《蜂蜜中丙三醇含量的测定方法》编制说明

1、 蜂蜜中丙三醇含量的测定方法编制说明一、标准制定的任务来源及意义1、任务来源本标准是根据中华全国供销合作总社供销厅函科字20139号文下达的任务，由中华人民共和国江苏出入境检验检疫局负责，名称为蜂蜜中丙三醇含量的测定方法，计划编号为2013gh-1-016。2、制定标准的意义蜂蜜是一种高度复杂的糖类饱和溶液，其中约 75 %是糖分，约 24 %是水分。文献1-3报道蜂蜜中某些适高渗压的酵母菌可将葡萄糖转化成多羟基化合物，如丙三醇、 d-阿糖醇和赤藓醇等。蜂蜜中丙三醇的含量与蜂蜜中存在的微生物数量之间有一定的关系。因此丙三醇含量可以作为衡量蜂蜜品质的一个指标，建立蜂蜜中丙三醇含量测定方法的标准就

2、很有必要。二、 编制依据本标准按照gb/t 1.1-2009标准化工作导则 第1部分 标准的结构和编写的要求进行编写。三、 研究背景及内容1 研究对象丙三醇，glycerol，俗称甘油，是一种无色、透明、无臭、粘稠液体。化学式c3h8o3，分子量92.09，cas登录号56-81-5。丙三醇能与水和乙醇互溶，能溶于乙酸乙酯，不溶于苯、氯仿、四氯化碳和石油醚等。2 蜂蜜中的丙三醇分析方法现状食品中丙三醇的分析方法有容量法、比色法、荧光光谱法、液相色谱法、气相色谱法4 和酶分析法5 ,6 ,上述方法中，适用于蜂蜜样品的有液相色谱法、酶分析法，衍生化-气相色谱-质谱联用法7。胡小钟等人7采用n ,o

3、-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（bstfa）作为衍生试剂，对蜂蜜中的丙三醇进行硅烷化衍生反应，对衍生产物进行气质联用分析。丙三醇的硅烷化衍生产物在气质联用仪上的响应高，且能与其他的多羟基化合物有效分离，抗干扰能力强。本标准对提取方法、硅烷化反应的条件、仪器条件进行了考察优化，并引入内标物1,2,4-丁三醇，对提取过程、衍生反应和离子化过程进行校正，采用内标法定量，进一步提高了定量的准确性。3 提取方式考察3.1提取溶剂的选择提取溶剂应对蜂蜜样品和丙三醇有较好的溶解性，能最大限度的提取蜂蜜样品中的丙三醇。同时，提取溶剂应不与衍生试剂bstfa发生反应。因此，排除极性较小的正己烷、石油醚、苯、四氯

4、化碳等溶剂，以及水、甲醇、乙醇等含羟基溶剂。3.1.1 提取溶剂的溶解能力根据上述原则，本标准选择了n,n-二甲基甲酰胺（dmf）、二甲亚砜（dmso）、吡啶和四氢呋喃四种溶剂进行考察。结果发现四氢呋喃不能溶解蜂蜜，其他三种溶剂能够完全溶解蜂蜜。因此，在后续研究中只考察dmf、dmso和吡啶三种溶剂。3.1.2 提取溶剂对衍生的影响在同等的加标水平下，分别考察蜂蜜加标样品在上述三种溶剂提取后的衍生效果。将阴性蜂蜜样品充分搅拌均匀，称取1. 0 g 于50 ml 干燥离心管中，加入内标物10 mg/ml的1,2,4-丁三醇50 l，添加10 mg/ml丙三醇50 l，涡旋混匀，用量筒准确加入25

5、 ml 不同衍生试剂（n,n-二甲基甲酰胺（dmf）、二甲亚砜（dmso）、吡啶，需提前加入无水硫酸镁除水），加盖涡旋使其充分溶解（如有必要需用手猛烈振摇），超声15min。准确量取0.05 ml溶液，加入衍生试剂n ,o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（bstfa）0.05 ml，涡旋1min，室温下静置10 min 后，加正已烷0.9 ml，定容至1.0 ml，加盖涡旋，高速离心，上层清液用吸管吸出，供气质联用仪测定。衍生后色谱图见图1-图3。图1 以吡啶为提取溶剂的衍生图谱图2以dmso为提取溶剂的衍生图谱图3以dmf为提取溶剂的衍生图谱由图1-3可见，三种提取溶剂下，丙三醇的衍生产物峰面

6、积相当，以dmf为提取溶剂时，丙三醇衍生产物峰面积略高一点；丁三醇的衍生产物峰面积：dmfdmso吡啶。且吡啶和dmso做提取溶剂时，衍生副产物较多，色谱图上杂峰较多。最终确定dmf作为提取溶剂。3.2 提取方式为了尽量完全的提取蜂蜜中的丙三醇，需要使蜂蜜完全溶解在溶剂中，常用的提取方式有：涡旋、超声、振荡等。蜂蜜样品的粘稠度各不相同，对于比较稀的蜂蜜样品，涡旋和超声可以使之充分溶解；对于比较粘稠的样品，仅靠涡旋和超声不足以使其溶解，这时候需要用手猛烈振摇。为了保证溶剂对蜂蜜中丙三醇的提取效率，最终确定涡旋、振摇和超声结合的方式，来确保蜂蜜充分溶解于溶剂。3.3 试剂和容器的除水由于水会消耗硅

7、烷化试剂bstfa，而dmf溶剂自身会含有少量水分，且放置过程中可能会吸收空气中的水分，因此dmf在使用前要加入适量无水硫酸镁做除水处理。同理，实验过程中用到的所有容器都应干燥。经考察确定的提取方法如下：将蜂蜜样品充分搅拌均匀，称取1. 0 g 于50 ml 干燥离心管中，加入内标物10 mg/ml的1,2,4-丁三醇50 l，涡旋混匀，用量筒准确加入25 ml n, n-二甲基甲酰胺（dimethyl formamide, dmf，需提前加入无水硫酸镁除水），加盖涡旋使其充分溶解（如有必要需用手猛烈振摇），超声15min。4 衍生化条件优化bstfa的硅烷化反应迅速、衍生产物稳定性好、在气质

8、联用仪器上响应高，非常适合用于气相的衍生化。但同时，bstfa非常活跃，考虑到蜂蜜样品中存在的其他多羟基化合物，可能与丙三醇竞争衍生反应，因此bstfa要大大过量，以免影响丙三醇的衍生；在满足灵敏度要求的情况下，用于衍生的样品量要尽量少，以减少其他衍生产物对丙三醇测定的干扰。衍生后，以正己烷涡旋提取衍生产物，离心后取正己烷层分析。4.1 衍生试剂用量考察将蜂蜜样品充分搅拌均匀，称取1. 0 g 于50 ml 干燥离心管中，添加10 mg/ml丙三醇20 l，加入10 mg/ml的1,2,4-丁三醇50 l，涡旋混匀，用量筒准确加入25 ml n, n-二甲基甲酰胺（dimethyl forma

9、mide, dmf，需提前加入无水硫酸镁除水），加盖涡旋使其充分溶解（如有必要需用手猛烈振摇），超声15min。准确量取0.05 ml溶液，加入不同量的衍生试剂n ,o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（bstfa）（0.025 ml, 0.05 ml和0.10 ml，各两个平行样），涡旋1 min，室温下静置10 min 后，加正已烷定容至1.0 ml，加盖涡旋，高速离心，上层清液用吸管吸出，供气质联用仪测定。结果发现：丙三醇和内标丁三醇在三种衍生试剂用量条件下，衍生产物峰面积没有显著性差异（见表）。最终，确定bstfa的用量为0.05ml。表1 不同衍生试剂用量条件下的衍生产物峰面积衍生试剂体

10、积（ml）丙三醇衍生产物1,2,4-丁三醇衍生产物0.0251620572242371622352268390.051659432284951637512296820.11706562356681713482349744.2 衍生时间考察确定了衍生试剂用量后，对反应时间进行考察（30s，1min，2min和5min）。将蜂蜜样品充分搅拌均匀，称取1. 0 g 于50 ml 干燥离心管中，添加10 mg/ml丙三醇50 l，加入10 mg/ml的1,2,4-丁三醇50 l，涡旋混匀，用量筒准确加入25 ml n, n-二甲基甲酰胺（dimethyl formamide, dmf，需提前加入无水硫

11、酸镁除水），加盖涡旋使其充分溶解（如有必要需用手猛烈振摇），超声15min。准确量取0.05 ml溶液，加入衍生试剂n ,o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（bstfa）0.05 ml，涡旋不同时间（30s，1min，2min和5min），室温下静置10 min 后，加正已烷0.9 ml，定容至1.0 ml，加盖涡旋，高速离心，上层清液用吸管吸出，供气质联用仪测定。结果发现：丙三醇和内标丁三醇在四种衍生时间条件下，衍生产物峰面积没有显著性差异（见表2）。最终，确定衍生时间为1 min。表2 不同衍生时间下的衍生产物峰面积衍生时间（min）丙三醇衍生产物1,2,4-丁三醇衍生产物0.5364539

12、192269378874223558136762520926736973522798923800622300763820022344545372745210173372583213541考察后确定的衍生条件：取待衍生溶液0. 05 ml 于1.5ml塑料离心管中，加入0. 05 ml n ,o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（bstfa），液体混匀器上快速混匀1 min，室温下静置10 min 后，加正已烷0.9ml，定容至1.0 ml，加盖涡旋，高速离心，上层清液用吸管吸出，供气质联用仪测定。5 内标物的选择胡小钟7等人采用外标法测定蜂蜜中的丙三醇，本研究考虑到引入内标可以校正衍生化反应进行的

13、程度以及离子化过程可能存在的差异，因此考虑选择一种与丙三醇结构相似，能够被bstfa衍生，在气质联用仪器上保留行为和响应都比较接近的化合物作为内标。1,2,4-丁三醇是与丙三醇在结构和性质上最为接近的化合物，同样都含有三个羟基，因此选择1,2,4-丁三醇作为内标。经实际衍生考察，发现1,2,4-丁三醇与丙三醇有比较接近的衍生效率，且二者的衍生产物在气相上可以实现基线分离。6 仪器条件6.1气相色谱条件色谱柱：j&w122-5532, 30 m0.25 mm i.d0.25 m，或相当者；载气：高纯氦气（99.999%），流速：1.0 ml/min；升温程序：60 保持1min，以30 /min

14、升至240 保持2 min，再以50 /min升至280；进样口温度：250 ；进样量：1 l；进样方式：脉冲不分流进样；接口温度：280 。该条件下，丙三醇衍生物和1,2,4-丁三醇衍生物的保留时间分别为4.8和5.2min。6.2 质谱参考条件离子源温度：230 ；四极杆温度：150 ；电离模式：ei；溶剂延迟时间：4.5 min；数据采集模式：选择离子监测方式（sim），监测离子见表3。表3 选择离子表待测物保留时间retention time (min)定性离子identification ions (m/z)定量离子quantitative ions (m/z)丙三醇衍生物4.811

15、7.0,205.0147.01,2,4-丁三醇衍生物5.2219.1103.1对丙三醇的衍生产物进行质谱全扫描，发现主要有73.1,103.1,117.0,147.0和205.0五个特征离子。对1,2,4-丁三醇衍生产物进行质谱全扫描，发现主要有73.1,103.1,147.0和219.1四个特征离子。由于二者结构相近，所以有可能产生相同的碎片离子，如73.1,103.1和147.0。由于二者在色谱上可以完全分离，所以即使同样的特征离子也不会干扰测定。选择丰度较高的147.0和103.1分别作为二者的定量离子。丙三醇衍生物的定量离子m/z147.0应为单硅烷化产物（m/z164）丢失一个羟基（

16、m/z17）产生；定性离子m/z117.0应为定量离子m/z147丢失两个甲基（m/z15）产生；定性离子m/z205.0可能为双硅烷化产物（m/z236）丢失一个羟甲基（m/z31）产生。1,2,4-丁三醇衍生物的定量离子m/z103.1应为单硅烷化产物（m/z194）丢失三甲基硅烷基（m/z73）和一分子水（m/z18）产生；定性离子m/z219.1应为双硅烷化产物（m/z266）丢失两个甲基（m/z15）和一个羟基（m/z17）产生。7 空白试验空白试验即除了不加样品，其他操作与样品衍生一样。用量筒准确加入25 ml n, n-二甲基甲酰胺（dimethyl formamide, dmf

17、，需提前加入无水硫酸镁除水），加盖涡旋使其充分溶解（如有必要需用手猛烈振摇），超声15min。准确量取0.05 ml溶液，加入衍生试剂n ,o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（bstfa）0.05 ml，涡旋不同时间（30s，1min，2min和5min），室温下静置10 min 后，加正已烷0.9 ml，定容至1.0 ml，加盖涡旋，高速离心，上层清液用吸管吸出，供气质联用仪测定。8 标准衍生为了保证标准衍生与样品衍生步骤操作的一致性，需要把丙三醇和内标1,2,4-丁三醇配在一起，丙三醇浓度分别为0.8 mg/l、2.0 mg/l、4.0 mg/l、10.0 mg/l、20.0 mg/l、 4

18、0.0 mg/l，内标1,2,4-丁三醇浓度都为20.0 mg/l。对应蜂蜜样品中的丙三醇含量为20 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、250 mg/kg、500 mg/kg、1000mg/kg。取0. 05 ml 系列混合标准溶液于1.5ml塑料离心管中，加入0. 05 ml n ,o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（bstfa），液体混匀器上快速混匀1 min，室温下静置10 min 后，加正已烷0.9ml，定容至1.0 ml，加盖涡旋，高速离心，上层清液用吸管吸出，供气质联用仪测定。四、方法学验证1 标准曲线和定量限丙三醇检测限为5 mg/kg，定量限20 mg/kg，线性

19、范围（linear range）0.8-100 g/ml。图4为阴性蜂蜜样品衍生后图谱。图5为10g/ml丙三醇标准溶液衍生图谱。图6为阴性蜂蜜样品中添加了500 mg/kg丙三醇后的衍生图谱。图7为丙三醇衍生产物的质谱图。图8为内标1,2,4-丁三醇衍生产物的质谱图。图4阴性蜂蜜样品衍生图谱图5 标准样品衍生图谱（10g/ml，1 丙三醇，2 1,2,4-丁三醇）图6 阴性蜂蜜样品添加丙三醇衍生图谱（500 mg/kg，1 丙三醇，2 1,2,4-丁三醇）图7 丙三醇衍生产物质谱图图8 1,2,4-丁三醇衍生产物质谱图2 回收率和精密度选取阴性蜂蜜样品，添加水平20, 100, 500 mg

20、/kg，每个添加水平6个平行样，回收率94.6-105.8%，精密度2.9-13.5 %。回收率数据见表4.表4阴性蜂蜜添加回收率和精密度（n=6）加标（mg/kg)20100500第一批19.5121.4477.620.6115.6491.722.9106.8486.718.495.9471.315.5101.3495.822.193.6511.2平均值19.8 105.8 489.1 回收率 %99.2 105.8 97.8 rsd %13.5 10.4 2.9 第二批22.496.1491.321.488.7487.618.7106.7475.316.2111.2512.817.993.5520.716.998.3527.6平均值18.9 99.1 502.6 回收率 %94.6 99.1 100.5 rsd %13.1 8.5 4.1 第三批23.1105.7497.218.491.6481.317.287.6486.522.4116.4477.620.5112.4516.823.7108.8508.5平均值20.9 103.