肝炎病毒抗原抗体检测的课件

1、2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的1 解放军第四七四医院 张和平 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的2 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的3 l 1.在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量 很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合， 而不再形成 “夹心复合物”。 l 2.类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，如 按常法测定，所得结果将低于实际的含量，这种现 象被称为钩状效应（hook effect） l 3.因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状 效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。 双抗体夹心法 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的4 乙型肝炎病毒（HBV）

2、标志物是国内实验室经常检测的项 目。两对半试剂生产厂家较多，试剂质量良莠不齐。五家 试剂公司分别为英科新创（厦门）科技有限公司、上海荣 盛生物技术有限公司、北京万泰生物药业有限公司、珠海 丽珠试剂有限公司、深圳月亮湾生物工程有限公司。各厂 家质量有较大差异,为了提高乙肝两对半的检验质量，避免 误诊、漏诊，以美国Abbott试剂作为参比试剂，对五家公司 的两对半试剂的质量进行了对比、评价4。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的5 1.本次试验Abbott Axsym系统检测标本中HBsAg结 果最高至210 S/CO，HBsAb结果最高至6000 mIU/mL，HBeAg最高至11600

3、PEIU/mL，以Abbott 试剂测定标本的S/CO值为横坐标，五家试剂测定 相应标本的OD值为纵坐标，分别绘出了HBsAg、 HBsAb及HBeAg的浓度关系图，故在实际应用中的 许多一步法试剂仍有HOOK效应存在。对于 HBsAg,A、C、D三家试剂存在HOOK效应；对于 HBsAb,A试剂存在HOOK效应；对于HBeAg，D试 剂存在HOOK效应。此结果可供临床检验部门参考。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的6 1.五家试剂对于HBsAg,HBsAb,HBeAg项目的可检出检测下 线分别为5.0 S/CO、17 mIU/mL、8.5 PEIU/mL, 2而Abbott试剂的阳性

4、检测下线分别是1.0 S/CO、10 mIU/mL、 0.28 PEIU/Ml,说明五家试剂在灵敏度上均低于Abbott试剂, 3.国外全自动分析仪系统检测灵敏度，速度，准确性均高于 国内试剂。 4.各家ELISA试剂的各个检测项目特异性均较好，灵敏度相 对较差，尤其是HBeAg，需要提高灵敏度11。结果表明 除对于HBcAb试剂D的相对灵敏度较差外；其它的各家试剂 的各个检测项目的相对灵敏度、相对特异性及总符合率均较 好，基本上能满足临床及实验室的要求，此结果可供参考。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的7 l4.因此在使用一步法试剂 测定标本中含量可异常增高的物 质（例如血清中HBs

5、Ag、AFP和尿液hCG等）时，应注意 可测范围的最高值。 l6.双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（ RF） 的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物 IgG的Fc段结合。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的8 7.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有R F，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶 标抗体结合，表现出假阳性反应。 8. 双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响， 已被列为这类试剂的一项考核指标。 9.假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的 决定簇，应分别包被固相和制备酶结合物。例 如 HBsAg的a决定簇，HBsAg有adr、adw、 ayr、

6、ayw4个亚型， 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的9 1.反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行 包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。 2. 此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因 此其敏感度相对高于间接法。 3.乙肝标志物中抗 HBs的检测常采用本法。 4.本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的 不同，寻找合适的标记方法。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的10 l1.其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争 与固相抗原结合。 l2.标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈 少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。 l3. 抗HBc.抗抗 Hbe: ELISA一

7、般采用此法。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的11 l卫生部规定乙肝试剂，丙肝试剂，艾滋病试剂， 梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫生部生物制品 检定所检定合格，并贴有防伪标签的产 品，试剂 应从灵敏度，特异性，精密度，稳定性，简便性， 安全性及经济性作出全面的评价。 灵敏度： l1）为试剂检出被检物质的最低量的能力； l2）为试剂对人群或大量样品中阳性检出的能力（假阴性 越少越好） ，取决于包被物的全面性。 3) 每一批新试剂应作实验对照 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的12 1.以卫生部临床检验中心的1ng/ml HBsAg质控血清，用正常血清稀释随标 本检测，国产试剂检测灵敏

8、度为0.5ng/ml，进口试剂为0.10ng/ml。 2.在122例ELISA阳性样本中,其中国产试剂检出88例，检出率为72.1%，进 口试剂全部检出，两者差异有显著性（X 2 =17.1，P3为大多数，占91.7%，表 明进口试剂灵敏 度高，不易漏检。国产试剂S/CO值分布以110之间为多数占65.5%，而 10.7区间有11例，占9%，表明试剂灵敏度欠佳。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的13 特异性：指试剂正确检定不存在的被检物质的能 力（无假阳性），取决于包被抗原（体）及标记抗 原（体）的纯度及特异性。 精密度：ELISA试剂一般指其批内CV，其值应小 于15%；定量试剂应同

9、时考察线性范围 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的14 稳定性：试剂在规定条件下能储存的时间，一般采 用破坏性试验即将试剂存放于37保存，定期测定 其灵敏度，特异性和精密度等指 标，直到其质量指 标开始下降为止，通常认为37每稳定一天相当于 4-10保存一个半月。 简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下， 实验和测定步骤越少越好，在定性试验中结果判断 简单明了，）定量试验结果计算也 应简单。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的15 安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无 传染性。 经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模 生产或技术进步降低成本而市场价格比较合理。 2021-7-

10、10肝炎病毒抗原抗体检测的16 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的17 l外观：液体组份无沉淀或絮状物，冻干组份呈白色或棕色 疏松体。 l溶解时间：冻干组分溶解时间3分钟。 l阴性参考品符合率（20份）：阴性参考品符合率（-/-）为 20/20 l阳性参考符合率(3份)：阳性参考品符合率（+/+）为3/3 lAdr亚型最低检出量（ng/ml）：0.5 lAdw亚型最低检出量（ng/ml）：1.0 lAy亚型最低检出量（ng/ml）1.0 l精密性（n=10）：CV15% (adr、adw、ayr、ayw4个亚型，) 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的18 l外观：液体组份无沉淀或絮

11、状物，冻干组份呈白色或 棕色疏松体。 l溶解时间：冻干组分溶解时间3分钟。 l阴性参考品符合率（30份）： 29/30 l阳性参考符合率(30份)：29/30 l精密性（n=10）：CV15% l灵敏度：要求L1、L2阳性，L3可阳性或阴性，L4阴性。 l 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的19 l外观：液体组份无沉淀或絮状物。 l阴性参考品符合率（20份）：18/20 l阳性参考符合率：HIV-1型参考品18份 阳性参考品符 合率18/18其中Ap11、Ap122.0且阿Ap12Ap11） lHIV-2 型参考品2份 阳性参考符合率2/2 l最低检出限参考品符合率（6份）：至少检出阳性

12、反应 3份（3/6） l且基质血清阴性反应 l精密性（n=10）：CV15% 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的20 l外观：液体组份无沉淀或絮状物 l阳性参考品符合率（10份）：10/10 l阴性参考符合率(20份)：20/20 l精密性（n=10）：CV15% 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的21 l1.试剂评价需要有权威的血清考核盘（ Panel） 进行检测，一般实验室不易从生检所或临检中心取 得，每进一次试剂评价一次也很麻烦。可以通过间 接的信息对试剂进行选 择。 2.根据该试剂生检所批批检定报告，了解其质量 水平，按照质量计划选择灵敏度高的或特异性高的 试剂； 3.通过

13、询问试剂包被物的组成，如原料来源（基 因工程或合成多肽），片段的组合（按比例混合或 化学合成），片段的长短等判断试剂的 优劣； 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的22 4.参考室间质评评价报告中对试剂的评价结果， 这比较客观公正，因为统计数字均来自各参评医 院，反映了试剂在某一地区的使用情况 5.根据权威部门发布的试剂评价结果，了解市 场上试剂的质量优劣。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的23 l 5.为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正 仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括 移液器（加样枪），水浴箱（温箱），洗板机和酶 标仪。 6.移液器：ELISA加样量小（5

14、-100l），其准确 性直接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度 指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准 确，一般应在10%以内； 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的24 7.水浴箱 经常检查水浴箱温度计所示的温度和 水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有1 的误差； 8.洗板机 每个厂家设置洗板后的残留液有各自 的规定一般不超过2ul ，人工扣板时，垫纸不湿， 定期检查管孔是否堵塞； 9.酶标仪 经常维护其光学部分，防止滤光片霉 变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的25 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的26 灵敏度：精确

15、配制6 ug/ml重铬酸钾（干燥）溶液（0.05 mo1L硫酸溶解），加入200 ul重铬酸钾溶液于小孔杯中， 以0.05 mo1L硫酸溶液作空白，于450 nm（参比波长650 nm）测定，其吸光度应 0.01 A。 准确度：准确配制：1mmo/L对硝基苯酚（提纯品）水 溶液，然后以10 mmo1L氢氧化钠溶液25 倍稀释之，加 入200 ul稀释液于小孔杯中，以10 mmo1L NaOH溶液作 空白，于405 nm（参比波长650 nm）检测，其吸光度应在 0.4 A（0.3950.408 A）左右。 经过多次在不同型号仪器间进行反复测定，结果发 现该标准物溶液在450nm波长处有一较为恒

16、定的测定值， 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的27 滤光片波长精度检查及其峰值测定 用高精度紫外可见分光光度计（波长精度0.3 nm）对不同 波长的滤光片进行光谱扫描，检测值与标定值之差即为滤 光片波长精度，其差值越接近于零且峰值越大表示滤光片 的质量越好，波长精度越高。 将不同波长的滤光片从酶标仪上卸下，用UV-2201型紫外- 可见分光光度计（波长精度0.3nm）于 可见光区对每个 滤光片进行扫描。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的28 滤光片波长精度检查滤光片波长精度检查理论基础：理论基础： 酶标仪的滤光片质量好坏，直接影响仪器的灵敏度高低，酶标仪的滤光片质量好坏，直接影

17、响仪器的灵敏度高低， 而滤光片的质量又是以其波长精度及其峰值指标来衡量的，而滤光片的质量又是以其波长精度及其峰值指标来衡量的， 因此因此滤光片波长精度及峰值是衡量酶标仪的重要参数之一滤光片波长精度及峰值是衡量酶标仪的重要参数之一， 这在厂家的仪器说明书中虽未曾提及，但在仪器的实际使用这在厂家的仪器说明书中虽未曾提及，但在仪器的实际使用 过程中，发现对滤光片波长精度和峰值进行检查是重要的也过程中，发现对滤光片波长精度和峰值进行检查是重要的也 是必要的，是必要的，通过检查可以发现滤光片的波长标定值与实测值通过检查可以发现滤光片的波长标定值与实测值 的符合程度，可以发现滤光片的质量是否符合要求。的符

18、合程度，可以发现滤光片的质量是否符合要求。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的29 (1).通道差检测是取一只酶标板小孔杯（杯底须光滑，透明， 无污染以酶标板架作载体， 将其（内含200ul甲基橙溶液吸 光度调至0.500A左右）置于8个通道的相应位置，蒸溜水调 零，1于490nm处连续测三次 ,观察其不同通道的检测器测量 结果的一致性，可用极差值来表示。 (2).孔间差的测量是选择同一厂家，同一批号酶标2板条（8 条共96孔 ）分别加入200ul甲基橙溶液（吸光度调至0.065 0.070 A）先后置于同一通道，蒸溜水调零,于490nm处检测。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的

19、30 为了提高酶标仪的检测速度，根据 96孔酶标板的规 格特点，目前大多数厂家的中、高档酶标仪均采用8通道 的检测器（部分中、低档酶标仪目前仍采用单通）因 而它们每个通道的检测能力是不尽相同的，它是仪器内 部的固有误差，与所测溶液浓度成正相关（不同检测器 对不同浓度溶液的响应能力不同），所以通道差是衡量 酶标仪性能良好与否的重要指标之一；其衡量指标用极 差表示，这与厂家推荐的指标是一致的；极差值越接近 于零，通道差越小，说明同一样品于不同通道检测结果 的一致性越好。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的31 采用的评价指标（士1.96 s）也是有利于结果校正的。另外， 在设计孔间差测量的操

20、作方法上，将200 ul甲基橙溶液吸 光度调至 0.0650.070 A，是充分考虑到加样器的误差 （上海求精公司，200 ul，士2CV），其目的是使加样 误差控制在仪器的分辨率（0.01 A）以下，这样也就避免 了孔间差结果不因加样误差而导致假性增高。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的32 方法:取8只小孔杯分别置于8个通道的相应位置，均 加入200ul蒸溜水并调零，于490nm处每隔30分钟 测一次， 观察各个通道4小时内吸光度的变化。 l 测量原理：零点飘移是评价仪器在一定时间内零点 吸光度的变化趋势，与波长无关，它间接地反映了仪器内部 检测系统在单位时间内处于工作状态下的稳定性及仪器的机 械性能情况（连续进板、检测、退出），故它是评估仪器内 部电路系统、光学系统（检测器）及机械系统良好与否的指 标。 2021-7-10肝炎病毒抗原抗体检测的