生化蛋白质化学

1、1.蛋白质是生物体内的结构高分子蛋白质是生物体内的结构高分子 蛋白质占干重蛋白质占干重 人体中（中年人）人体中（中年人） 人体人体 45% 水水55% 细菌细菌 50%80% 蛋白质蛋白质19% 真菌真菌 14%52% 脂肪脂肪19% 酵母菌酵母菌 14%50% 糖类糖类1% 白地菌白地菌50% 无机盐无机盐7% 2.蛋白质是一种生物体内的功能高分子蛋白质是一种生物体内的功能高分子 （1）酶的催化作用）酶的催化作用 （2）调节作用）调节作用(多肽类激素多肽类激素) （3）运输功能）运输功能 （4）运动功能）运动功能 （5）免疫保护作用）免疫保护作用(干扰素干扰素) （6）接受、传递信息的受体）

2、接受、传递信息的受体 （7）毒蛋白）毒蛋白 第一节第一节 蛋白质分子组成成分蛋白质分子组成成分 一一.元素组成元素组成 这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳碳 5055 氮氮 1517% 铁铁,锌锌,锰锰,钼钼,碘碘,铜等铜等 氢氢 68 硫硫 04 氧氧 2023 磷磷 01% 蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和 少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、 碘、锌和铜等。碘、锌和铜等。 其中氮含量较恒定

3、，平均其中氮含量较恒定，平均16%。一克氮。一克氮=6.25克蛋白质。这克蛋白质。这 是凯氏定氮法的依据。是凯氏定氮法的依据。 二二 .蛋白质的水解蛋白质的水解 酸水解：酸水解： 蛋白质蛋白质 氨基酸氨基酸 碱水解：碱水解： 蛋白质蛋白质 氨基酸氨基酸 酶水解：酶水解： 蛋白质蛋白质 氨基酸氨基酸 证明：氨基酸是蛋白质的基本组成单位证明：氨基酸是蛋白质的基本组成单位 R CH NH 3 + COO- R CH COOH NH2 三三.基本组成单位氨基酸基本组成单位氨基酸 （一）氨基酸的结构通式（一）氨基酸的结构通式 1.特点特点 氨基酸的结构决定了有如下特点：氨基酸的结构决定了有如下特点： 具

4、有酸性的羧基和碱性的氨基具有酸性的羧基和碱性的氨基 -碳为手性碳原子碳为手性碳原子 由于由于R侧链不同侧链不同 或 分子型分子型离子型离子型 2.非蛋白氨基酸非蛋白氨基酸 NH2CH2COOHCH2CH2 NH2CH 2CH COOHCH 2 CH2 NH2 C O NH CH 2 CH COOHCH2OH NH2 NH2CH2 CHCOOH CH2CH2 NH2 NH2CH2COOHCH2 高丝氨酸：高丝氨酸： -丙氨酸：丙氨酸： -氨基丁酸：氨基丁酸： 鸟氨酸：鸟氨酸： 瓜氨酸：瓜氨酸： HO N COOH H 高半光氨酸：高半光氨酸： HS-CH2-CH2-CH-COOH NH2 4-羟

5、脯氨酸：羟脯氨酸： 胱氨酸：胱氨酸： H2N-CH-CH2-S-S- CH2-CH-NH2 COOH COOH 4-羟赖氨酸：羟赖氨酸： H2N-CH2 -CH-CH2-CH2-CH -COOH OH NH2 中性中性AA（15种）种） （1）按）按R基团的酸碱性分类基团的酸碱性分类 酸性酸性AA（Glu，Asp） 碱性碱性AA (His, Arg,Lys) （2）按）按R基团的基团的 疏水性疏水性R基团基团AA 极性分类极性分类 不带电荷极性不带电荷极性R基团的基团的AA 亲水性亲水性R基团基团AA 正电荷正电荷 带电荷带电荷R基团的基团的AA 负电荷负电荷 脂肪族脂肪族AA （3）按）按R

6、基团的基团的 芳香族芳香族AA 化学结构分类化学结构分类 杂环族杂环族AA 杂环亚杂环亚AA （二）（二）.氨基酸的分类氨基酸的分类 第二节第二节 氨基酸性质氨基酸性质 一、氨基酸的光学活性和光吸收性质一、氨基酸的光学活性和光吸收性质 CHO CHOH CH 2OH L（-）甘油醛甘油醛 COOH CH R NH2 L氨基酸氨基酸 CHO CHOH CH 2OH COOH CNH2 R H D（+）甘油醛甘油醛 D氨基酸氨基酸 n酪氨酸的酪氨酸的 max 278nm， 278=1.4x103; n苯丙氨酸的苯丙氨酸的 max259nm， 259=2.0 x102; n色氨酸的色氨酸的 max

7、279nm， 279=5.6x103; 氨基酸的光吸收氨基酸的光吸收 二二. .氨基酸的两性离解性质氨基酸的两性离解性质 氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨 基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以 质子化质子化(-NH(-NH3 3+ +) )形式存在，羧基是以离解状态形式存在，羧基是以离解状态(-COO(-COO- -) )存在。存在。 H3N-CH-COOH R + H3N-CH-COO- R + H2N-CH-COO- R - pK1 + H+ H

8、+ - pK2 + H+ H + “ +” 正离子正离子 PHPI 1.两性离子两性离子 同一分子中既有带正电荷的离子又有带负电荷的离子，同一分子中既有带正电荷的离子又有带负电荷的离子， 这种离子称为两性离子。这种离子称为两性离子。 2. 氨基酸的等电点氨基酸的等电点 在一定的在一定的pH值时，氨基酸分子中氨基的离解度等于羧基的离解值时，氨基酸分子中氨基的离解度等于羧基的离解 度时，所含的度时，所含的-NH3+和和-COO-数目正好相等，净电荷为数目正好相等，净电荷为0。在电。在电 场中既不向正极移动，也不向负极移动，这一场中既不向正极移动，也不向负极移动，这一pH值即为氨基酸值即为氨基酸 的

9、等电点，简称的等电点，简称pI。 在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处 于两性离子状态。于两性离子状态。 3. 氨基酸的等电点的计算氨基酸的等电点的计算 H3N-CH-COOH R + H3N-CH-COO- R + H2N-CH-COO- R - pK1 + H+ H + - pK2 + H+ H + K1= H3N-CH-COOH R + H3N-CH-COO- R + * H+ H2N-CH-COO- R K2= H3N-CH-COO- R + * H+ K1* H3N-CH-COOH R + H3N-CH-COO-

10、 R + * H+ H2N-CH-COO- R K2= H3N-CH-COO- R + * H+ * K1* H3N-CH-COOH R + H2N-CH-COO- R K2= H+ * 2 等电点时：等电点时：H3N-CH-COOH R + H2N-CH-COO- R = K1*K2= H+ 2 等式两边取负对数等式两边取负对数 -logK1+(-logK2)=2(-logH+)pK1+pK2=2pH 侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和和 pK2的算术平均值：的算术平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2 同样，对于侧链含有

11、可解离基团的氨基酸，其同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性值也决定于两性 离子两边的离子两边的pK值的算术平均值。值的算术平均值。 酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI = (Pk-COOH + pKR-COOH )/2 碱性氨基酸：碱性氨基酸：pI = (pK- NH2 + pKR-NH2 )/2 pH PI溶液对溶液对PI而言偏碱而言偏碱 带带+ PI与与PH的关系的关系 pH =PI溶液对溶液对PI而言中性而言中性 不带电不带电 pH PI溶液对溶液对PI而言偏酸而言偏酸 带带 - 等电点等于酸性基团离解常数与碱性基团离解常数之和的一半等电点等于酸性基团离解常数与碱性基团离

12、解常数之和的一半 或等电点等于两性离子两侧离解基团离解常数之和的一半或等电点等于两性离子两侧离解基团离解常数之和的一半 Lys的解离如下：的解离如下： COO CHNH3 CH2 4 NH3 COO CHNH2 CH2 4 NH3 NH3 COO CHNH2 CH2 4 NH2 NH3 NH3 COOH CHNH3 CH2 4 NH3 KCOOHK - K- - H+H+H+ （+）（+） （ ）（- - ） Asp解离如下解离如下: COOH CHNH3 CH2 COOH COO CHNH3 CH2 COOH COO CHNH3 CH2 COO NH3 COO CHNH2 CH2 COO K

13、-COOHK-COOHK - H+H+H+ -COOH （+） （-） （-） （） 4.根据滴定曲线求根据滴定曲线求pK 6.02 2.34 9.69 丙氨酸的滴定曲线丙氨酸的滴定曲线 三三.氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应 1.与甲醛反应与甲醛反应 （一）（一）.氨基参与的反应氨基参与的反应 2.与亚硝酸反应与亚硝酸反应 R CH NH 3 + COO- R CHON2CO2 HNO2 + + 此反应是此反应是Vanslyke定氮的原理定氮的原理 3. 与与2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）反应）反应 4.与异硫氰酸苯酯（与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应）的反应 N H S:C C

14、HC O R1 HNNHCHC O R2 N C O CH NH SC R1 NCS NHCHC O R2 NCHC O R1 H H NH2CHC O R2 + N(CH3)2 SO2Cl H2NCHC RO HNCHC RO SO2 N(CH3)2 + 水解 N(CH3)2 SO2 HNCHC RO OH + 氨基酸 丹磺酰氯 多肽N-端 丹磺酰N-端氨基酸 丹磺酰氨基酸 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可 以与以与N-N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰- -氨基酸。氨基酸。 此法的优点是丹磺酰此法

15、的优点是丹磺酰- -氨基酸有很强的荧光性质，检测氨基酸有很强的荧光性质，检测 灵敏度可以达到灵敏度可以达到1 1 1010-9 -9mol mol。 （二）（二）.羧基参与的反应羧基参与的反应 H2NCHC RO HNCHC ROORn CCHHNOH n-1 N-端氨基酸 C-端氨基酸 ORn CCHH2NOHH2NCHC RO NHNH2+ H+ NH2NH2 氨基酸酰肼 C-端氨基酸 此法是多肽链法是多肽链C-C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热， C-C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化端氨基酸即从肽链上解离出

16、来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化 物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-端氨基酸分离端氨基酸分离。 （三）（三）.氨基和羧基共同参与的反应氨基和羧基共同参与的反应茚三酮反应茚三酮反应 0 0 0 0 0H 0 0H H2O 0 0H 0 H H2N-CH-COOH R NH3+RCHO+CO2 0 0H 0 0H 0 0H 0 H + NH3 + 0 0H 0 0H 0 =N 0O- O 蓝紫色化合物蓝紫色化合物 入入max=570nm 脯氨酸，羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质脯氨酸，羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质 入入max=440nm 0

17、0H 0 0H C C C O- O N + CO2 HN COOH 反应名称反应名称反应试剂反应试剂反应基团反应基团颜色颜色用途用途 黄色反应黄色反应浓硫酸浓硫酸+浓硝酸浓硝酸苯基、酚基苯基、酚基黄色黄色Phe Tyr 米伦反应米伦反应硝酸汞（亚汞）硝酸汞（亚汞）酚基酚基红色红色 Tyr 乙醛酸反应乙醛酸反应乙醛酸乙醛酸吲哚基吲哚基紫红紫红Trp 坂口反应坂口反应萘酚萘酚+NaClO胍基胍基红色红色Arg 福林酚反应福林酚反应磷钼酸磷钼酸+磷钨酸磷钨酸酚基、吲哚基酚基、吲哚基蓝色蓝色Trp Tyr Pauly反应反应重氮盐重氮盐咪唑基咪唑基 酚基酚基 棕红色棕红色 桔黄色桔黄色 His Ty

18、r 巯基反应巯基反应亚硝酸亚铁氰酸亚硝酸亚铁氰酸 钠钠 巯基巯基红色红色Cys （四）（四）R-侧链反应侧链反应-呈色反应呈色反应 第三节第三节.氨基酸的分离与测定氨基酸的分离与测定 一一.层析法层析法 二二.电泳法电泳法 三三.氨基酸的测定氨基酸的测定 第四节第四节 肽肽 一一.肽的结构肽的结构 CCNCCNCCNCCNC CH2CHCH2CH2CH2 COO - OHCO2HCH2 CONH2 OH CH3 H3N + OOOO HHHHH HHHH SerValTyrAsp Gln CH3 N-端 C-端 肽键 氨基酸残基氨基酸残基肽单位肽单位 二二.生物活性肽生物活性肽 +H3N-Ty

19、r-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Met-脑啡肽脑啡肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Leu-脑啡肽脑啡肽 H2N-CHCH2CH2-CO-NH-CH-CO-NH-CH2COOH COOH CH2 SH 2GSH GS-SG 1.谷胱甘肽谷胱甘肽 2.脑啡肽脑啡肽 Cys Tyr ILe Gln Asn Cys Pro Leu GlyNH2 S S 牛催产素 Cys Tyr Gln Asn Cys Pro S S Phe Arg GlyNH2 牛加压素 Leu-(D)phe-pro-val-Orn Orn-val-pro-(D)phe-Leu 4.短杆

20、菌肽短杆菌肽S（Orn鸟氨酸）鸟氨酸） 3.催产素催产素 第五节第五节 蛋白质分类蛋白质分类 一一.根据蛋白质分子形状分类根据蛋白质分子形状分类 1.球状蛋白球状蛋白 2.纤维状蛋白纤维状蛋白 二二.根据蛋白质的组成成份分类根据蛋白质的组成成份分类 1.单纯蛋白单纯蛋白 2.结合蛋白结合蛋白 清蛋白清蛋白 核蛋白核蛋白 谷蛋白和醇溶谷蛋白谷蛋白和醇溶谷蛋白 色蛋白色蛋白 精蛋白和组蛋白精蛋白和组蛋白 糖蛋白糖蛋白 硬蛋白硬蛋白 脂蛋白脂蛋白 磷蛋白磷蛋白 第六节第六节 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 一一.蛋白质的氨基酸组成蛋白质的氨基酸组成 1.蛋白质的氨基酸组成可用残基重量百分数表示蛋白

21、质的氨基酸组成可用残基重量百分数表示 147 165 如：如：100克胰岛素克胰岛素 分析得到分析得到 phe8.6克，其重量百分数为：克，其重量百分数为： 残基分子量残基分子量 氨基酸含量氨基酸含量 * = 8.6* = 7.7克 氨基酸分子量氨基酸分子量 2.根据百分组成计算氨基酸的分子个数根据百分组成计算氨基酸的分子个数 如：胰岛素分子量为如：胰岛素分子量为6000，丙氨酸占，丙氨酸占4.6%，氨基酸个数为：，氨基酸个数为： = 3 4.6%*6000 89 氨基酸的百分含量氨基酸的百分含量*蛋白质分子量蛋白质分子量 氨基酸的分子量氨基酸的分子量 a盐键（离子键 ） b氢键 c疏水相互作

22、用力 d 范德华力 e二硫键 f 酯键 二二.蛋白质分子结构中的化学键蛋白质分子结构中的化学键 维系蛋白质分子的一级结构：肽键维系蛋白质分子的一级结构：肽键 维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的二级结构：氢键 维系蛋白质分子的三级结构：疏水相维系蛋白质分子的三级结构：疏水相 互作用力互作用力 维系蛋白质分子的四级结构：范德华维系蛋白质分子的四级结构：范德华 力、盐键、氢键、疏水相互作用力力、盐键、氢键、疏水相互作用力 离子键离子键氢键氢键 范德华力范德华力疏水相互作用力疏水相互作用力 氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键 氢

23、键、范德华力虽然键能小，但数量大氢键、范德华力虽然键能小，但数量大 疏水相互作用力对维持三级结构特别重要疏水相互作用力对维持三级结构特别重要 盐键数量小盐键数量小 二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越 稳定稳定 三三.蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 （一）氨基酸组成成分分析（一）氨基酸组成成分分析 （二）末端分析（二）末端分析 1.N-末端末端 2.C-末端末端 （三）肽链伸展与分离（三）肽链伸展与分离 （四）肽链部分水解与肽段分离（四）肽链部分水解与肽段分离 （五）肽段的氨基酸顺序测定（五）肽段的氨基酸

24、顺序测定 （六）由各段顺序推断的氨基酸顺序（六）由各段顺序推断的氨基酸顺序 CH3S： CH2 CH2 CHNHCNHCHC OOR +BrC+N Br- CH3S+ CH2 CH2 CHNHCNHCHC OOR CN CH3SC N CH 2 CHNHCNHCHC OOR CH2 + H2O + CH2 CHNHC O CH2 OH3N + CHC OR 高丝氨酸内酯 化学法：化学法： 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 酶法酶法 -HN-CH-CO-NH-CH-CO R1 R2 胰酶：胰酶： R1 =Lys

25、.Arg 胰凝乳酶：胰凝乳酶： R1=phe.Tyr.Trp 胃酶：胃酶： R1 R2= phe.Tyr.Trp.leu 嗜热菌蛋白酶：嗜热菌蛋白酶： R2= phe.Tyr.Trp.leu.Ile.val Glu酶：酶： R1=Glu.Asp Arg酶：酶： R1=Arg 第七节第七节 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构 二级结构二级结构 超二级结构超二级结构 结构域结构域 三级结构三级结构 四级结构四级结构 高级结构高级结构 -螺旋螺旋 -折叠折叠 -转角转角 自由回折自由回折 高级结构的概念：高级结构的概念： 1. -螺旋螺旋 一一. 二级结构二级结构 要点：要点： 螺旋的角度与高度螺旋的

26、角度与高度 维持螺旋的作用力维持螺旋的作用力 影响螺旋稳定的因素影响螺旋稳定的因素 螺旋的种类螺旋的种类 2. -折叠折叠 要点：要点： 肽链的走向（肽链的走向（种类）种类） 残基轴心距离残基轴心距离 维持的作用力维持的作用力 影响螺旋稳定的因素影响螺旋稳定的因素 3.-转角转角 4.自由回折自由回折 氢键氢键 1800的回转的回转 二二.超二级结构超二级结构 三三.三级结构三级结构 要点：要点： 形状形状 折叠折叠 作用力作用力 四四.四级结构四级结构 一级结构一级结构二级结构二级结构超二级结构超二级结构结构域结构域三级结构三级结构亚基亚基四级结构四级结构 第八节第八节 蛋白质分子结构与功能

27、蛋白质分子结构与功能 一一.一级结构与功能的关系一级结构与功能的关系 1.胰岛素的结构与功能胰岛素的结构与功能 2.血红蛋白结构与功能血红蛋白结构与功能 3.细胞色素细胞色素C与生物进化与生物进化 二二.蛋白质的构象与功能的关系蛋白质的构象与功能的关系 三三.个别蛋白质结构与功能个别蛋白质结构与功能 1.纤维状蛋白纤维状蛋白角蛋白角蛋白 2.丝心蛋白丝心蛋白 第九节第九节 蛋白质的性质蛋白质的性质 一一.蛋白质的分子大小蛋白质的分子大小 1.根据化学成分测定最小相对分子质量根据化学成分测定最小相对分子质量 据其百分含量可计算出最低相对分子质量：据其百分含量可计算出最低相对分子质量： 最小相对分

28、子质量最小相对分子质量 （成分的相对分子或原子质量）（成分的相对分子或原子质量） 已知成分的百分含量已知成分的百分含量 2.沉降系数沉降系数 一个一个S单位，为单位，为110-13秒秒 蛋白质的沉降系数：蛋白质的沉降系数：1200S，相对分子质量越大，相对分子质量越大，S值越大值越大 由沉降系数由沉降系数S可根据斯维得贝格可根据斯维得贝格Svedberg方程计算蛋方程计算蛋 白质分子的相对分子质量：白质分子的相对分子质量： M=RST/D1i R：气体常数：气体常数 T：绝对温度：绝对温度 D：扩散系数：扩散系数 ：溶剂的密度：溶剂的密度 S= dx/dt 2x 蛋白质与多肽一样，能够发生两性

29、离解，也有等电点。在等电点时蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时 (Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中， 蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋 白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳 (Elect

30、rophoresis)。 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体 溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小 分子杂质除去。分子杂质除去。 二二. 蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的两性离解和电泳现象 三三.蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 四四. 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子

31、量大小、 所带的电荷和水化作用有关。所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。 蛋白质的性质与它们的结构密蛋白质的性质与它们的结构密 切相关。某些物理或化学因素，能切相关。某些物理或化学因素，能 够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋 白质理化性质改变并导致其生理活白质理化性质改变并导致其生理活 性丧失。这种现象称为蛋白质的变性丧失。这种现象称为蛋白质的变 性性. 大部分蛋白质均含有大部分蛋白质均含有 带芳香环的苯丙氨酸、

32、酪氨带芳香环的苯丙氨酸、酪氨 酸和色氨酸。这三种氨基酸酸和色氨酸。这三种氨基酸 的在的在280nm 附近有最大吸附近有最大吸 收。因此，大多数蛋白质在收。因此，大多数蛋白质在 280nm 附近显示强的吸收。附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白利用这个性质，可以对蛋白 质进行定性鉴定。质进行定性鉴定。 蛋白质在等电点蛋白质在等电点 pH条件下，不发条件下，不发 生电泳现象。利生电泳现象。利 用蛋白质的电泳用蛋白质的电泳 现象，可以将蛋现象，可以将蛋 白质进行分离纯白质进行分离纯 化化。 第十节第十节 蛋白质分离纯化及测定蛋白质分离纯化及测定 一一. 蛋白质分离纯化的方法蛋白质分离纯化的方

33、法 根据分子大小根据分子大小 根据溶解性根据溶解性 根据电荷根据电荷 根据吸附力根据吸附力 根据特异性亲和力根据特异性亲和力 透析透析/超过滤法超过滤法 密度梯度离心法密度梯度离心法 凝胶过滤法凝胶过滤法 PI沉淀法沉淀法 盐溶和盐析法盐溶和盐析法 电泳法电泳法 离子交换法离子交换法 凝胶过滤法凝胶过滤法 凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构 一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子 进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒

34、间隙流下来，洗脱液体积洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积 小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱 下来，洗脱体积大下来，洗脱体积大 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名： Sephadex 二二. 蛋白质浓度测定的方法蛋白质浓度测定的方法 1.福林试剂反应福林试剂反应 福林试剂：磷钼酸福林试剂：磷钼酸-磷钨酸将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨磷钨酸将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨 蓝混合物。酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）蓝混合物。酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应） 2.双缩脲法双缩脲

35、法 在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应 蛋白质蛋白质-铜络合物，铜络合物， 灵敏度提高灵敏度提高100倍倍 3.考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250 本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色，与蛋白的亲和力强，灵敏度高，本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色，与蛋白的亲和力强，灵敏度高， 1-1000微克微克/毫升毫升 4.凯氏定氮法凯氏定氮法5.紫外吸收法紫外吸收法 R CH NH 3 + COO- R CH COOH NH2 三三.基本组成单位氨基酸基本组成单位氨基酸 （一）氨基酸的结构通式（一）氨基酸的结构通式 1.特点特点 氨基酸的结构决定了有如下特点：氨基酸的结构决定了有如下特点： 具有酸性的羧基和碱性的氨基具有酸性的羧基和碱性的氨基 -碳为手性碳原子碳为手性碳原子 由于由于R侧链不同侧链不同 或 分子型分子型离子型离子型 2.非蛋白氨基酸非蛋白氨基酸 NH2CH2COOHCH2CH2 NH2CH 2CH COOHCH 2 CH2 NH2 C O NH CH 2 CH COOHCH2OH NH2 NH2CH2 CHCOOH CH2CH2 NH2 NH2CH2COOHCH2 高丝氨酸：高丝氨酸： -丙氨酸：丙氨酸： -氨基丁酸