实验六_植物原生质体分离及融合

1、实验六实验六 植物原生质体分离及融合植物原生质体分离及融合 实验目的 了解植物原生质体分离、融合基本原理。了解植物原生质体分离、融合基本原理。 掌握植物原生质体分离、融合基本过程。掌握植物原生质体分离、融合基本过程。 实验原理 植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的 意义，它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望意义，它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望 成为作物改良的有力工具之一。成为作物改良的有力工具之一。 植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸裸 露细胞露细胞”，是开展基础

2、研究的理想材料。其中酶解法分离，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离 原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由 纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半 纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。 原生质融合 外界因素作用下，两个或两 个以上植物细胞合并成一个多核细 胞的过程称为植物细胞融合，或植 物体细胞杂交。 原生质融合 许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质 体融合，现在被广

3、泛采用并证明行之有效的融合方体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方 法是聚乙二醇法是聚乙二醇(PEG)(PEG)法、高法、高CaCa高高pHpH法和电融合法：法和电融合法： 我们本次试验主要用的是聚乙二醇法。我们本次试验主要用的是聚乙二醇法。 PEG PEG作为一种高分子化合物，作为一种高分子化合物，20205050的浓度能的浓度能 对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生 收缩与粘连，随后用高收缩与粘连，随后用高CaCa高高pHpH法进行清洗使原生法进行清洗使原生 质体融合得以完成。质体融合得以完成。 PEG PEG诱导融合的机理：诱导融

4、合的机理：PEGPEG由于含有醚键而具负极性，与由于含有醚键而具负极性，与 水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当 PEGPEG分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而 使之粘连。使之粘连。 PEG PEG也能连接也能连接Ca2+Ca2+等阳离子，等阳离子，Ca2+Ca2+可在一些负极化基团可在一些负极化基团 和和PEGPEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在 原生质体膜上的原生质体膜上的PEGPEG分子可被洗脱这样

5、将引起电荷的紊乱分子可被洗脱这样将引起电荷的紊乱 和再分布从而引起原生质体融合：高和再分布从而引起原生质体融合：高CaCa高高pHpH由于增加了质由于增加了质 膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压 冲击对融合也可能起作用。冲击对融合也可能起作用。 原生质融合 材料：材料： 植物叶片（菠菜叶片）植物叶片（菠菜叶片） 用具：用具： 倒置显微镜，离心机，过滤筛（倒置显微镜，离心机，过滤筛（100100 目），漏斗，烧杯，吸管，长注射针，注目），漏斗，烧杯，吸管，长注射针，注 射器（射器（510ml510ml）等。）等。 试剂：试剂：

6、 1.1.纤维素酶纤维素酶2% 2% ，果胶酶，果胶酶1%1% （在（在0.65M0.65M甘露醇，甘露醇，0.05M0.05M氯化钙和氯化钙和0.1%MES0.1%MES中，中， pHpH调至调至5.66.05.66.0） 实验用品 2. 0.16M2. 0.16M氯化钙溶液（内含氯化钙溶液（内含0.1%MES0.1%MES） Ph5.6Ph5.6。 3. 22%3. 22%蔗糖溶液蔗糖溶液 4. 30%4. 30%聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）溶液）溶液 5. 5. 高高pHpH高钙洗脱液（高钙洗脱液（Ph=9Ph=9） 0.1M 0.1M氯化钙氯化钙 0.1M 0.1M梨酶醇梨酶醇

7、0.5ml/100ml 1M Tris 0.5ml/100ml 1M Tris 6. 0.24M 6. 0.24M 氯化钙氯化钙 纯化后的叶肉原生质体纯化后的叶肉原生质体 原生质体融合 PE G 法法 原原 生生 质质 体体 的的 融融 合合 图图 示示 图 一 烟 草 叶 肉 细 胞 和 洋 葱 根 尖 细 胞 原 生 质 体 融 合 （ 40 ） 图 二 烟 草 叶 肉 和 洋 葱 根 尖 细 胞 原 生 质 体 的 异 源 融 合 PEG法法原原生生质质体体的的融融合合图图示示 图一烟草叶肉细胞和洋葱根尖 细胞原生质体融合（40） 图二烟草叶肉和洋葱根尖细 胞原生质体的异源融合 双荧光素

8、标记双荧光素标记 实验方法 （一）原生质体的分离收集 1.取菠菜叶片撕去下表皮，称0.2g,切成小块 放到10ml酶液中，在26下酶解45小时， 或含酶量减半过夜，期间轻轻摇动几次。 2用100目的过滤筛过滤。 3.用与滤液等体积的0.16M氯化钙溶液冲洗过 滤筛，使冲洗液冲入过滤液。 4.滤液用离心机100300rpm，离心5分钟， 弃上清液。 5.沉淀中加入0.16M氯化钙溶液12ml于沉淀， 轻摇使之悬浮，用带长针头的注射器自离 心管底部轻轻地加入68ml 22%蔗糖溶液， 使之形成界面。 6.静置待原生质体形成一条带时弃去上、下 液及残渣，用吸管收集原生质体。 7.用.0.24M 氯化钙溶液洗涤一次，离心吸取 上清液。 8.沉淀中加入12ml.0.16M氯化钙溶液悬于 沉淀，用血球计数板计数，使原生质体密 度为200000个/ml。 9.取一滴于载玻片上，低倍镜观察原生质体 的纯度和完整性，也可用荧光显微镜检查。 （二）原生质体融合操作 1.取上述原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻 片上，静置10分钟，使原生质体沉淀在载 玻片上。 2.在两滴悬液之间加一滴30%聚乙二醇（PEG） 溶液，使3滴溶液相连，室温下（15 20）。作用510分钟，在显微镜下观察 原生质体粘连情况。 原生质体融合的作用：