细菌内毒素检测

1、 细菌内毒素，英文称作Endotoxin，是G-菌 细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源 性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之 释放出一种内源性热原质，作用于体温调 节中枢引起发热。细菌内毒素的主要化学 成分为脂多糖。 鲎试剂与细菌内毒素的凝胶反应的作鲎试剂与细菌内毒素的凝胶反应的作 用机理用机理 鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理是鲎的 血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内 有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。 当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂） 接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固 蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝 胶状态。 凝胶法检测细菌内毒素的步

2、骤凝胶法检测细菌内毒素的步骤 鲎试剂的灵敏度复核 干扰实验 检测 鲎试剂的灵敏度复核鲎试剂的灵敏度复核 细菌内毒素检查法至药典收载以来，每版都有明 确规定：每使用新批量的鲎试剂或试验条件发生 了任何可能影响检验结果改变时，应进行鲎试剂 灵敏度的复核试验。 鲎试剂的灵敏度，即鲎试剂在本试验法规定的条 件下能检测出的细菌内毒素标准液或供试品溶液 中的最低内毒素浓度（用Eu/ml表示) 鲎试剂灵敏度复核的意义鲎试剂灵敏度复核的意义 (1)考查操作技能 (2)考查实验条件 (3)验证鲎试剂灵敏度是否准确，鲎试剂在生产、销 售、运输、储存过程中易受诸如温度、光线、时 间等外界因素的影响，使促凝活力降低

3、(4)验证细菌内毒素标准品的效价是否准确 因此为了保证细菌内毒素检查法的准确可靠性， 检验者应对每批新购入的鲎试剂进行灵敏度的复 核 鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核 0.9mLBET水 0.9mLBET水 0.9mLBET水 100EU/mL 10EU/mL 1EU/mL 0.1mL 0.1mL 0.9mL 0.5EU/mL,4 0.9mLBET水0.9mLBET水0.9mLBET水0.9mLBET水 20.50.25 0.9mL 0.9mL0.9mL0.9mL 2、0.5、0.254个浓度每个平行4 管，另加两管BET水做阴性对照. 结果结果1234 2 0.5 0.25 当最大浓度2管均

4、为阳性，最低浓度0.25管均为 阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效按下 式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂 灵敏度的测定值(c)。 cantilg(X/4) 式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点 浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳 性结果的浓度。 当c在0.52(包括0.52)时，方可用于细菌 内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵 敏度。 干扰试验干扰试验 按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试 品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大 有效稀释倍数(MVD)的溶液，按鲎试剂灵敏 度复核试验项下操作。 MVD=cL/ 式中L为供试品的细菌内毒素限值； c为供试品

5、溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c 等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的 单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌 粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最 小有效稀释浓度c=/L； 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度EU/ml) 1mLBET水 4 1mLBET水1mLBET水1mLBET水 2 0.50.25 4 1mL 1mL 1mL1mL 0.5mL 0.5mL供试 品溶液 0.5mL供试 品溶液 0.5mL供试 品溶液 0.5mL供试 品溶液 0.5mL0.5mL0.5mL 2 0.50.25 C组 B组 结果结果1234 A B 2 0.5

6、0.25 C 2 0.5 0.25 D 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性 ，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内 时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应 终点浓度的几何平均值(Es和Et): Es=antilg(Xs/4) Et=antilg(Xt/4) 式中Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度 的对数值(lg)。 当Es在0.52(包括0.5和2)及Et在0.5Es2Es(包 括0.5Es和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用 。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干 扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释， 再重复干扰试验

7、。 可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜 的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰 。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会 使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再 经过处理的供试品溶液进行干扰试验。 当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项 的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。 当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境 中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新 进行干扰试验。 检测检测 按表2制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍 数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液 来制备溶液A和B。 供试品溶液 供试品阳性对 照溶液 内毒素标 准溶液 0.1mL 0.1mL 0.9mL 0.3mL 0.3mL 100EU/mL 0.9mLBET水 10EU/mL 0.9mLBET水 4 0.9mLBET水 1EU/mL 0.3mLBET水 2 0.3mL供试品溶液 0.3mL供试品溶液