实验二 淀粉酶活性测定预习报告

1、生物化学实验预习报告实验二 酶活力测定方法的研究（1） 淀粉酶活性的研究一、研究背景酶即由活细胞产生的一类有催化活性的生物大分子，大多数由蛋白质组成（少数为RNA），它是细胞赖以生存的基础，细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。酶的催化具有高效性、专一性、可调节性以及需要温和的条件。酶的催化活性受外界条件的影响，如温度、pH、离子强度、激活剂、抑制剂等均会使酶活性发生改变。另外，酶在工业生产及生活中应用广泛，如酱油、食醋以及酿酒工业都需要酶的参与，洗衣粉加入酶增强去污能力等。酶活性的测定具有较强的实际意义，例如某些酶活性的变化可以引起特定的疾病，测定这些酶的活性可以作为疾病

2、诊断的一个依据。淀粉酶是水解淀粉糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的方式，可以分为-淀粉酶与-淀粉酶等。休眠的种子中只有-淀粉酶存在，而-淀粉酶在种子萌发过程中才形成。测定淀粉酶的活性具有重要的意义，淀粉酶普遍存在于植物体内，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，其活性高低可以衡量种子萌发速率，也可以作为水稻抗逆性的生化指标（如干旱、盐、重金属胁迫）。本实验中我们通过学习经典的淀粉酶活力测定方法，分析具体的实验细节，从而获取酶活力测定的相关理念。二、研究目标1.掌握酶活力测定的一般思路与方法；2.进一步熟练使用分光光度法测定物质浓度；3.测定-淀粉酶与-淀粉酶的活性；4.体会并掌握实验细节

3、的设计与分析方法。三、研究策略两种淀粉酶的特性有所不同，-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；-淀粉酶不耐热，在7015min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化-淀粉酶，测出-淀粉酶的活力（原因分析见思考题6）。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（-淀粉酶活力+-淀粉酶活力），再减去-淀粉酶的活力，就可求出-淀粉酶的活力。另外，实验时分别设置对照组和测定组，从而排除无关变量的干扰。采用分光光度法测定产物麦芽糖的含量，计算出产物的生成速率，从而表征出淀粉酶的活性。四、研究方案及可行性分析1.研究方案（1）酶的获取淀粉酶广泛存在

4、于禾谷类的种子（特别是萌发后的种子）中，所以取萌发的小麦种子研磨浸提得到初始酶液。（2）反应过程-淀粉酶耐高温，而-淀粉酶在高温下易被钝化。可以在适当的高温下水浴处理，使-淀粉酶失去活性的同时-淀粉酶活性基本不受影响，与此同时，设置对照组以排除干扰因素（如萌发种子中产生的麦芽糖），对比测定组与对照组的差异，分解淀粉所得到的产物就可以认为是-淀粉酶催化的产生，即可得到-淀粉酶活力。另外，不做高温处理，在相同的测定条件下测量-淀粉酶和-淀粉酶的总活力，最终计算两者差值得到-淀粉酶活力。（3）产物检测（还原糖的3,5-二硝基水杨酸法）淀粉水解产物为麦芽糖，在碱性条件下，麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸共

5、热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），在一定范围内，麦芽糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，在520nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。（4）酶活力计算酶活力的大小与所催化反应的产物生成速率成正比。规定淀粉酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数（mg麦芽糖min-1g-1鲜重）。以分光光度法测定产物麦芽糖的含量，计算出产物的生成速率，最终得到酶的活力。2.可行性分析就实验方案本身而言，利用两种酶的不同特性加以处理，钝化其一，测定另一种酶的活性，方案合理，简便易行，具有可操作性；实验材料（萌发

6、小麦种子）可在实验室获得，所需各种试剂均为实验室常备试剂，温度控制可通过恒温水浴箱实现，分光光度计、离心机等仪器实验室都有，所用试管、研钵等器具实验室均可提供；实验所用时间约为3h（下文会粗略计算），可在规定时间内完成，故时间上有可行性。综合以上各点，本实验具有很大的可行性。3.预期实验结果-淀粉酶与-淀粉酶活力均可通过本实验测得。五、具体实验设计1.实验仪器及试剂722型光栅分光光度计、托盘天平、离心机、恒温水浴锅、具塞刻度试管、50ml容量瓶、研钵、石英砂、微量可调手动移液器、1%淀粉溶液、蒸馏水、pH5.6的柠檬缓冲液、3,5-二硝基水杨酸溶液（DNS）、麦芽糖标准液（1mg/ml）、0

7、.4MNaOH溶液、萌发的小麦种子2.实验步骤（1）初始酶液的制取（30min）2g萌发的小麦种子少量石英砂，研磨至匀浆少量多次用蒸馏水转移到50ml容量瓶至40ml颠倒浸提1520min定容至刻度混匀3500r/min离心20min上清液（2）-淀粉酶活性的测定（50min）管号对照管测定管C1C212酶提取液加入1ml，70（0.5）恒温水浴15min冰浴立即在冰浴中冷却柠檬缓冲液1ml水浴40（0.5）恒温水浴15min0.4MNaOH4ml，摇匀40预热的淀粉溶液2ml，摇匀水浴40恒温水浴5min0.4MNaOH4ml，摇匀（3）-及-淀粉酶总活性的测定（25min）取所制取的酶液5

8、ml，放入100ml容量瓶中，定容至刻度，混合均匀得到稀释后酶液。管号对照管测定管C3C4（+）1（+）2稀释后酶液加入1ml柠檬缓冲液1ml水浴40（0.5）恒温水浴15min0.4MNaOH4ml，摇匀40预热的淀粉溶液2ml，摇匀水浴40恒温水浴5min0.4MNaOH4ml，摇匀（4）麦芽糖含量的测定A.标准曲线的制作（35min）管号1234567麦芽糖标准溶液体积（ml）00.10.30.50.70.91.0dH20（ml）10.90.70.50.30.10DNS加入1ml，混匀水浴沸水浴5min稀释冷却，用蒸馏水稀释至15ml，混匀OD520B.样品的测定（35min）管号对照管

9、测定管对照管测定管C1C212C3C4（+）1（+）2溶液体积（ml）1mlDNS加入1ml，混匀水浴沸水浴5min稀释冷却，用蒸馏水稀释至15ml，混匀OD520（5）计算公式-淀粉酶活性（mg麦芽糖min-1g-1鲜重）=（A-A）样品稀释总体积/样品总重（g）5min；（-+-）淀粉酶总活性（mg麦芽糖min-1g-1鲜重）=（B-B）样品稀释总体积/样品总重（g）5min；A-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度A-淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度B-及-淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度B-及-淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度3.实验所需时间预计所用时间共计约3h。4.某些试剂与操作的作用（1）1%淀

10、粉溶液 淀粉酶的反应底物（2）pH5.6的柠檬缓冲液 提供和维持淀粉酶反应的最适pH（3）0.4MNaOH溶液 使酶失去活性（对照组）；为还原糖的3,5-二硝基水杨酸反应提供碱性环境；使对照组与测定组的处理保持一致，降低实验无关变量所造成的误差（4）3,5-二硝基水杨酸溶液 显色剂，与麦芽糖反应，通过颜色变化深浅反映出麦芽糖含量（5）麦芽糖标准溶液（1mg/ml） 绘制标准曲线（6）酶提取液70恒温水浴15min 使-淀粉酶活性丧失而-淀粉酶活性不受影响（7）酶液40恒温水浴15min 在最适温度下，使酶的活性维持在最高状态（8）淀粉溶液40预热 使底物的的温度与酶的最适温度相吻合，避免混合时

11、温度发生变化导致酶的活性不在最高状态。（9）酶与底物混合液40恒温水浴5min 最适温度下，酶具最大活性与底物以恒定初速度反应生成产物（10）-及-淀粉酶总活性测定时酶液的稀释 总活性较高，分解淀粉速率较快，短时间内底物迅速减少，因而测定得到的便不是初速度，而稀释后降低酶的比活，便于测定（11）产物与3,5-二硝基水杨酸沸水浴共热5min 使麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸在加热条件下充分反应，显色充分，生成有色物质的量及颜色稳定（12）测定吸光度前溶液稀释至15ml 低浓度下分光光度法对待测物质浓度的测定更加准确5.误差分析本实验中容易产生误差的地方有以下几个：（1）初始酶液的制取。为减小误差，

12、应研磨充分，浸提充分，准确定容。（2）进行钝化和保温这两步。因此，为了保证酶促反应时间的准确性，必须做到准确记录时间，尽量减小因各管保温时间不同而引起的误差，同时恒温水浴温度变化不应超过0.5，以减少温度变化所引起的误差。（3）显色的过程。显色需要加热15min，时间要严格控制，而且沸水浴的水位要高于试管中试剂的高度，因为显色程度与水温和加热时间有关系。六、质疑及相关思考1.酶活力测定时需要测反应的初速度，这就需要底物浓度要足够大且远远超过酶量，测定时间要在最初的几分钟内（底物转化量5%）。在本实验中，底物为2ml1%的淀粉溶液，测定反应时间为5min，这两个标准是如何确定的？而这些标准是否真

13、的满足酶活力测定的要求？ 2.本实验-淀粉酶活性测定时是在70恒温水浴15min，该条件下-淀粉酶活性是否真的完全丧失，而-淀粉酶活性是否完全不受影响？我想不能完全这么肯定，如果是这样的话，这些因素所带来的误差有多大？是不是可以忽略？3.实验中显色时间控制为15min，我在其他资料上也看到有的将显色时间定为10min1，我们知道，显色时间过短，待测物质未与显色剂充分反应，显色不充分，会使测定结果偏低；若显色时间过长，生成有色物质可能会由于不稳定而被分解，也会使测定结果偏低。那么本实验最恰当的显色时间到底应该确定为多少？4.关于-淀粉酶活性的计算上，我们分别测定了-淀粉酶活性以及（-+-）淀粉酶

14、总活性，用二者的差值作为-淀粉酶活性。这个思路是否科学？因为我们不知道-淀粉酶与-淀粉酶之间是不是有协同之类的作用，也就是说当两者同时存在时可能会对彼此的活性产生影响，从而导致我们测量到的总活性并不是-淀粉酶与-淀粉酶各自单独存在时的活性之和。七、思考题1.酶活力测定实验的总体思路你认为应该是什么？首先应该从生物材料中提取要测定的目标酶，可以通过分离纯化技术或者直接钝化与目标酶催化反应有关的其他酶的活性；其次由于酶促反应速率可用单位时间内底物消耗量或产物生成量来表示，但产物从无到有，浓度变化大，容易检测，故一般通过测定产物的生成量来计算酶的活力；最后要测定初速度，酶促反应进程曲线是双曲线，在最

15、初数分钟的反应时间内产物的生成量才与时间成正比，因此只有初速度才能反映出酶的真实催化能力。2.根据上述总体思路你认为在设计酶活力测定实验时，对结果可信性影响最大的是哪方面？为什么？在该项设计中要注意什么？对结果可信性影响最大的就是测定的条件，即测定酶活力时必须在该酶的最适条件下进行。因为只有在最适条件下酶才具有最大的活性，我们才能够测得该酶所催化进行化学反应的最大反应速率。在设计最适条件时，应该注意以下几个方面：要选择合适的底物（专一性不强的酶或者催化可逆反应的酶），且底物浓度要足够高，使酶达到饱和状态；选择合适的辅因子、活化剂、变构剂的种类及浓度；反应混合液的最适温度、pH、缓冲液种类及浓度

16、、离子强度等；指示酶与辅助酶的种类和浓度（酶偶联法）；其他影响酶活性的因素，如抑制剂、氧化剂、表面活性剂等。3.淀粉酶和转氨酶的作用各自有什么特点？在设计其酶活力测定的具体实验方案时你认为主要应该有哪些针对性的考虑？淀粉酶属于水解酶类，一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等，水解1，4-糖苷键，根据其水解产物异构类型的不同可分为-淀粉酶与-淀粉酶等。转氨酶属于转移酶类，是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶，参与氨基酸的合成与分解。转氨酶的种类很多，其中以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）最为重要。转氨酶的辅基是磷酸吡哆醛或磷酸吡哆胺，两者在转氨基反应中可互相变换。在具体设计实验方案时

17、，我们要保证在这两种酶分别在各自的最适条件下进行酶活力测定，需要考虑底物、温度、pH、辅因子等条件。4.酶促反应的特点？规定酶活力单位的作用？酶活力单位想表征的内涵是什么？其规定有什么特点？酶促反应的特点：通过降低反应的活化能，使催化具有高效性；催化的底物和产物具有高度的专一性；反应受严格的调节，可以通过各种方式调节酶活性来控制反应的进行；反应条件温和，通常能在常温、常压、中性pH下进行。通过规定酶活力单位可定量表示酶催化效率即活性的大小。一个酶活力单位是指在特定条件（25，其它为最适条件）下，1min内能催化1mol底物转化为产物所需的酶量，或是转化底物中1mol有关基团的酶量。其规定特点是

18、以酶促反应产物的生成速度来间接衡量和表征酶活性的大小。5.以你们对相关知识的理解，试着分析一下禾谷类种子（如：小麦）萌发过程中的主要代谢特点及可能存在的代谢途径。禾谷类种子在萌发早期由于吸胀作用，会使与代谢相关的一些酶类及细胞器得到活化，同时修复细胞内的生物膜系统和DNA。物质代谢的主要特点是贮藏器官发生贮藏物质分解，转化成可溶性物质运到胚部作为呼吸基质或者合成新细胞的材料，在这些过程中会发生淀粉、脂肪与蛋白质的分解及转化。以淀粉的代谢为例，-淀粉酶主要存在于胚乳中，-淀粉酶的产生则与赤霉素诱导有关，盾片及胚芽鞘产生赤霉素转运到糊粉层，诱导糊粉层合成-淀粉酶，随后分泌到胚乳，胚乳水解产生的可溶

19、性糖输送到生长部位，作为营养利用。此外，植酸、维生素、同工酶、DNA、RNA、矿物质等均参与代谢。而对于能量代谢，呼吸作用明显呈现出上升下降上升下降四个阶段2，种子活力越高、萌发时条件越好，ATP生成量就越多。可能存在的代谢途径有氨基酸代谢、糖酵解、三羧酸循环和磷酸戊糖途径。6.众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化b-淀粉酶的活力而测a-淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化a-淀粉酶活力去测b-淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什麽？若采取钝化a-淀粉酶活力去测b-淀粉酶活力，则需要将条件控制到pH3.6以下，这就需要使用缓冲液，那么就要考虑到缓冲液中的组分（如某些离子）有可能是所测酶的激活剂或者抑制剂，这样一来所测酶的活性就不准确了。另一方面，强酸性条件会催化淀粉的水解，导致我们测得的产物不全是由酶催化得到，所以就无法计算酶的活性。相比较而言，温度变量是容易控制的，而且高温对a-淀粉酶活性基本无影响，却对b-淀粉酶有较好的钝化作用，并且在测定过程中我们没有引入其他的影响因子。这种设计思路说明一方面在