动物细胞培养基本技术

1、细胞培养基本技术 细胞培养的甚本概念 n 传代：传代： n 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种 到新的培养器皿中。 n 原代培养原代培养 n 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在 传代之前称为原代培养。 n n细胞培养：使用单个细胞悬液 n组织培养：使用组织块（O.51立方毫米）或 薄片（厚0.2 毫米） n器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整 个器宫 原代培养细胞的生命归宿 n原代培养期 n传代期 n衰退期 n有限细胞系，无限细胞系 n细胞系 cell line n细胞株 cell strain 培养细胞的分类分类 根据形态大致的不同，主要根据形态大致的不同，主要2 2类

2、：类： 上皮样上皮样 成纤维细胞样成纤维细胞样 其它，不定型其它，不定型 上皮样细胞型上皮样细胞型 名称：名称：仅形态上似体内仅形态上似体内 来源：来源：来源于外胚层来源于外胚层，内胚层细胞，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤上皮性肿瘤 形态：形态：类似类似体内的体内的上皮细胞上皮细胞 扁平扁平，不规则多角形不规则多角形，中有圆形核，中有圆形核 生长特点生长特点 易相连易相连成片成片 相靠相靠紧密相连紧密相连成薄层成薄层 铺石状铺石状 成纤维细胞样细胞成纤维细胞样细胞 名称：名称：凡在凡在培养中形态与成纤维细胞类似培养中形态与成纤

3、维细胞类似的的 来源：来源：由由中胚层间充质组织起源中胚层间充质组织起源的组织的组织 如：真正的成纤维细胞如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮 形态：形态：似体内成纤维细胞似体内成纤维细胞的形态的形态 胞体梭形胞体梭形或不规则三角形或不规则三角形 胞质向外伸出胞质向外伸出23个个长短不等的突起长短不等的突起 中有卵圆形核中有卵圆形核 生长特点生长特点 排列成排列成放射状放射状 并不紧靠连成片并不紧靠连成片， 常有几个常有几个伸长的细胞突起伸长的细胞突起 培养细胞的特性 n 培养细胞的生长方式 n贴附生长： n 必须贴附于支持物表面才能生长。见于

4、各种实体 瘤细胞 n悬浮生长： n 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表 面。见于各种造血系统肿瘤细胞 每代贴附生长细胞的生长过程 n游离期 n贴壁期 n潜伏期 n对数生长期 n停止期（平台期） n游离期： n 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮 期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 n 10分钟一4小时 n贴壁期： n 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4 小时贴壁。 n 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 n 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋 白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于 底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附

5、着。 n进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） n潜伏期 n 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一 n般为624小时。 n对数生长期： n 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研 究。 n停止期（平台期）： n 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 n 机制：接触抑制、密度依赖性 密度抑制（密度抑制（Density inhibition）或接触抑）或接触抑 制（制（Ccontact inhibition） n1958年年Abercrombie 等学者提出的一种现象，等学者提出的一种现象， 培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细培养细胞再生长过程中多发生分裂

6、增殖，细 胞移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其胞移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其 他方向，保证细胞不会重叠，一但接触，这他方向，保证细胞不会重叠，一但接触，这 种活动即可停止。种活动即可停止。 n所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时， 细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也 相应减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。相应减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。 培养细胞生长的条件 n1 细胞的营养需要 n2 细胞的生存环境 n 温度: 37 n O2 n CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3

7、- n pH: 7.2-7.4 n 渗透压 n 3 无污染 n 4 无毒 基本操作技术和要求基本操作技术和要求 n由于体外培养的细胞没有抗感染能力，由于体外培养的细胞没有抗感染能力， n因此防污染是决定培养成功的首要条件。因此防污染是决定培养成功的首要条件。 n一切操作需要一切操作需要保证无菌保证无菌和有条不紊。和有条不紊。 微生物污染的途径微生物污染的途径 n空气：一般培养室环境中每立方米含菌空气：一般培养室环境中每立方米含菌 数不应超过数不应超过1 5个个 n器材：器材：CO2温箱温箱 n操作操作 n血清血清 n组织样本组织样本 微生物污染的检测微生物污染的检测 n真菌污染真菌污染 n细菌

8、污染细菌污染 n支原体污染：可做如下检测支原体污染：可做如下检测 n（1）相差显微镜检测）相差显微镜检测 n（2）荧光染色法）荧光染色法 n（3）电镜检查）电镜检查 n（4）DNA分子杂交或支原体培养等方分子杂交或支原体培养等方 法法 微生物污染的防治微生物污染的防治 n 防止的关键在于严格无菌操作，防止的关键在于严格无菌操作， 把好每一个关口，尽可能禁止其它污染把好每一个关口，尽可能禁止其它污染 的物品进入培养操作环节：的物品进入培养操作环节： 微生物污染的防治微生物污染的防治 n抗生素：抗生素：一般用常用量的一般用常用量的5 10倍作冲击疗法。倍作冲击疗法。 用药用药24 48h后，再换常

9、规培养液。后，再换常规培养液。 n加温处理：加温处理：根据支原体对热敏感的特点，将根据支原体对热敏感的特点，将 受支原体污染的细胞放置在受支原体污染的细胞放置在41 C作用作用5 10h，最长不超过最长不超过18h，以杀灭支原体。以杀灭支原体。 n动物体内接种：动物体内接种：将支原体污染的细胞接种在将支原体污染的细胞接种在 同种动物的皮下或腹腔，借动物体内的免疫同种动物的皮下或腹腔，借动物体内的免疫 系统消灭支原体。待一定时间后取出细胞，系统消灭支原体。待一定时间后取出细胞， 做原代培养再进行繁殖。做原代培养再进行繁殖。 细胞交叉污染细胞交叉污染 n有效防止细胞交叉污染：有效防止细胞交叉污染：

10、 n所有器具要严格区分所有器具要严格区分 n不要触及培养液瓶瓶口不要触及培养液瓶瓶口 n细胞系都要在早期留有充足的冻存储备，细胞系都要在早期留有充足的冻存储备， 可以复苏早期冻存细胞使用。可以复苏早期冻存细胞使用。 培养室内的无菌技术培养室内的无菌技术 n培养前的准备：按实验计划和程序培养前的准备：按实验计划和程序 准备准备 物品，作到心中有数物品，作到心中有数 n培养室和超净台：定期全面彻底消毒培养室和超净台：定期全面彻底消毒 n培养用品的无菌处理：高压灭菌、过滤、培养用品的无菌处理：高压灭菌、过滤、 酒精消毒酒精消毒 n实验中无菌培养操作：均在火焰近处进实验中无菌培养操作：均在火焰近处进

11、行，实验用品需火焰灭菌，冷却后接触行，实验用品需火焰灭菌，冷却后接触 培养细胞，以防烧死细胞培养细胞，以防烧死细胞。 实验准备 实验用品：实验用品： n超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器， 酸缸 nCO2培养箱 n倒置显微镜 n酶标仪、微孔板震荡器 n液氮罐 n自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 n耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管 n压力蒸汽消毒器：压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 n电热干燥箱：电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃 n器皿消毒 n滤器：滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 n酶液等均采用滤过法除菌 n超净工作台：超净工作

12、台：为细胞操作提供无菌环境 n紫外灯紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 n培养皿和培养板等表面消毒 n 超净台 n n超净工作台的工作 原理是利用鼓风机 驱动空气遁过高效 滤器除去空气中的 尘埃颗粒，使空气 得到净化。净化空 气徐徐通过工作台 面，使工作台内构 成无菌环境。 滤 器 CO2培养箱 nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。 n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： n 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖 微松，以保证通气。 n 保持培养箱内空气干净。定期消毒 n（90 ，14 h)。 n箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中 以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发

13、。 自动双重纯水蒸馏器 纯水仪 酶标仪 微孔板震荡器 培 养 板 培养瓶 n 常用玻璃器皿清洗 n浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、小时）、 n流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干烘干 清洁液的配制 n新的橡胶制品洗涤方法：新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH0.5mol/L NaOH煮沸煮沸1515 分钟，流水冲洗分钟，流水冲洗;0.5mol/L HCl;0.5mol/L HCl煮沸煮沸1515分钟，流分钟，流 水冲洗水冲洗; ;自来水煮沸自来水煮沸2 2次次, ,每次每次1515分钟分钟; ;蒸馏

14、水煮蒸馏水煮 沸沸2020分钟，分钟，5050度烤干备用。度烤干备用。 n清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于 自来水中过夜，用纱布或棉签和自来水中过夜，用纱布或棉签和5050度清洗液刷度清洗液刷 洗，浸于清洁液中洗，浸于清洁液中1515分钟，流水冲洗（分钟，流水冲洗（15152020 遍遍),),蒸馏水浸洗三次，双蒸水中泡蒸馏水浸洗三次，双蒸水中泡2424小时，晾小时，晾 干备用。干备用。 塑料制品的清洗塑料制品的清洗 2 细胞培养用液的配制 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g K

15、Cl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml n消化液： n 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞 间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 n n 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细 胞。 n 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液 配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。 n胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 n用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 培养基 n培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培 养基和合成培养基。 n天然培养基：天然培

16、养基： n天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 n优点：营养成分丰富，培养效果好 n缺点：来源受限。 n 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 n 易发生支原体污染 合成培养基 n 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数 量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培 养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 n 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化 合物、无机盐和其它一些辅助物质。 n 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 n 成本低 n 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生 长需要。 n 人工合成培养基只能维持

17、细胞生存， 要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量 的天然培养基（如血清）。 n血清中含有： n多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） n多种金属离子 ； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 n各种生长因子 n转移蛋白 n不明成分 n一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞 不死但支持细胞生长一般需加 10血清 n对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的 复杂成分至今尚未完全清楚 n血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子 或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学 特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 n在生长因子、蛋

18、白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要 用无血清培养基培养细胞 n无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因 子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 n无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 n1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近 20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和 增殖。 n无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和 稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的 程序。 n向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于 某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细

19、胞株的生长。即使 同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 n血清质量好坏是实验成败的关键。 n常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血 清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 n优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、 支原体、病毒污染。 n血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟 n血清的消毒：过滤除菌 n抗菌素的使用： n 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以 抑制可能存在的细菌的生长。 n 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉 素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位

20、。 n 庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳 定 n两性霉素B 完全培养基的组成 n基础培养基 80一95 n血清 5一20 n碳酸氢钠 2.0 g/L n青、链霉素 各100卑位毫升 培养基的配制 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10） 细胞传代方法 n 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 n 1悬浮生长细胞传代 n 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养 液后再混匀传代。 n 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l 2一23

21、，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 n 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） n 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹 n打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 n 3贴壁生长细胞传代 n 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。 贴壁生长细胞传代方法： n1 吸光培养瓶中的培养液 n2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准） n静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 n3 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 n4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 n5 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 n

22、6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 n7 将后者放入培养箱中培养。 细胞计数 n血细胞计数器：手工计数细胞 nCoulter计数仪：人工计数 培养细胞活力测定 n细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段 之一。 n任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成， 从形态上区别死、活细胞是困难的。 n1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞 群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞 的增殖能力 n 克隆形成率比克隆形成数接种细胞数 n缺点：操作繁琐 n优点：精确、可靠 2台盼蓝法 n 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占 n细胞中的百

23、分比表示细胞恬力 n n已淘汰 3 四唑盐（MTT）比色法 n四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝， n 四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不 溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞 没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色 结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪 测定OD值 n MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试 n验、肿瘤放射敏感性实验等。 n操作步骤 n （1）单细胞悬液接种于96孔培 养板；103-104细胞/孔，每孔培养 基总量200微升（96孔培养板每孔 容积370微升），37、5

24、nCO2培养箱中培养一段时间（根据 实验目的决定培养时间） n （2）加入2毫克毫升的MTT 液（50微升孔）；继续培养3小 时。 n （3）吸出孔内培养液后，加入 DMSO液（150微升孔），将培 养板置于微孔板扳荡器上振荡10分 钟，使结晶物溶解。 n （4）酶标仪检测各孔OD值（检 测波长为570 nm）。记录结果，绘 制细胞生长曲线 四唑盐（MTT）比色法 细胞冻存和复苏 n细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。 细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少 入力、经费，减少污染，减少细胞生物 学特性变化。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 n当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：当细胞冷到零度以下，可

25、以产生以下变化： 细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高， 并在细胞内形成冰晶。并在细胞内形成冰晶。 n如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内 不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结 晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复 苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰 晶，即冰晶的重结晶。晶，即冰晶的重结晶。 低温保护剂的应用 n在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻 存效果。存效果。 n常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透，它是一种渗透 性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水 的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使 细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形 成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细 胞的损伤。胞的损伤。 细胞冻存步骤细胞冻存步骤 n取生长对数期的细胞消化成细胞悬离心取生长对数期的细胞消化成细胞