培训-紫外可见风光光度计的原理及应用

1、劳模工作室化验组劳模工作室化验组 20172017年年4 4月月1414日日 主主 讲：周讲：周 众众 “紫外紫外- -可见分光光度计的原理及应用可见分光光度计的原理及应用”培训培训 紫外紫外-可见分光光度计的原理及应用可见分光光度计的原理及应用 利用紫外-可见分光光度计测量 物质对紫外-可见光的吸收程度（吸 光度）和紫外-可见吸收光谱来确定 物质的组成、含量，推测物质结果 的分析方法，称为紫外-可见吸收光 谱法或紫外-可见分光光度法，属于 分子吸光分析法。 1 紫外紫外-可见分光光度计的原理可见分光光度计的原理 根据物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行根据物质对光的吸收特征和吸收强度，对

2、物质进行定性定性和和 定量定量的分析方法，称为分光光度法。的分析方法，称为分光光度法。 光区波长在光区波长在200-380nm 紫外光区紫外光区 光区波长在光区波长在380-780nm 可见光区可见光区 1 紫外紫外-可见分光光度法的原理可见分光光度法的原理 2 紫外紫外-可见分光光度法的特点可见分光光度法的特点 3 紫外紫外-可见分光光度计的组织结构可见分光光度计的组织结构 4 影响检测的因素及减小误差的方法影响检测的因素及减小误差的方法 5 紫外紫外-可见分光光度计的日常保养可见分光光度计的日常保养 A=abc A吸光度吸光度 a比例常数比例常数 b液层厚度，光在溶液中的距离液层厚度，光在

3、溶液中的距离 c浓度浓度 紫外紫外-可见分光光度法的原理可见分光光度法的原理 紫外紫外-可见分光光度计是通过测定样品待测组分在吸收池中对特定波长光的选择可见分光光度计是通过测定样品待测组分在吸收池中对特定波长光的选择 性吸收的大小来确定样品的含量的。待测组分的浓度与吸光度的关系服从性吸收的大小来确定样品的含量的。待测组分的浓度与吸光度的关系服从郎伯郎伯比比 耳定律耳定律。 当当b、c均为均为1时，时，A=a称为吸光系数称为吸光系数 若若c以以mol/L表示，表示，b以以cm表示，则此表示，则此 常数称为摩尔吸光系数用常数称为摩尔吸光系数用表示表示 A=bc 的大小，取决于物质（溶质、溶剂）的的

4、大小，取决于物质（溶质、溶剂）的 本性和光的波长本性和光的波长 A=abc 物质不同物质不同，其吸光系数不同，所以，其吸光系数不同，所以可作为物质的特性常数；可作为物质的特性常数；越大，灵敏度越高越大，灵敏度越高 溶剂不同溶剂不同，其吸光系数不同，其吸光系数不同 光的波长不同光的波长不同，其吸光系数不同，其吸光系数不同 不同的物质有不同的吸收峰和不同的物质有不同的吸收峰和max，这是物质定性的依据之一，这是物质定性的依据之一 物质定量在物质定量在max处测定其吸光度，灵敏度最高处测定其吸光度，灵敏度最高 郎伯郎伯比耳定律只有当入射光是单色光并且溶液为稀溶液时才适用比耳定律只有当入射光是单色光并

5、且溶液为稀溶液时才适用 紫外紫外-可见分光光度法的原理可见分光光度法的原理 u 灵敏度高灵敏度高 适用于微量组分的测定，一般可测定适用于微量组分的测定，一般可测定10-6g级的物质级的物质 u 准确度较高准确度较高 相对误差一般在相对误差一般在15%之内之内 u 方法简便方法简便 操作容易，仪器设备简单，分析速度快操作容易，仪器设备简单，分析速度快 u 应用广泛应用广泛 主要应用于无机和有机化合物的定量分析及配合物的组成、稳定常数的测定，也能应用主要应用于无机和有机化合物的定量分析及配合物的组成、稳定常数的测定，也能应用 于有机化合物的鉴定及结构分析，还可对同分异构体进行鉴别于有机化合物的鉴定

6、及结构分析，还可对同分异构体进行鉴别 紫外紫外-可见分光光度法的特点可见分光光度法的特点 光源 提供入射光的装置，要求 能够发射连续的具有足够 强度和稳定的入射光，且 辐射强度随波长的变化尽 可能小，使用寿命长 单色器 将光源辐射的复合光色散 成单色光的光学装置，一 般由狭缝、色散元件及透 镜系统组成 吸收池 用于盛放试液的装置，一 般可见光区用玻璃吸收池， 紫外光区用石英吸收池 显示器 普通仪器一般集成在主机 上，功能更加齐全、精密 的仪器一般需要连接电脑 检测器 将光信号转变成电信号的 装置，要求灵敏度高、响 应时间短、稳定性好等 紫外紫外-可见分光光度计的组织结构可见分光光度计的组织结构

7、 p 选择合适的显色剂，灵敏度高，选择性好，产物稳定选择合适的显色剂，灵敏度高，选择性好，产物稳定 p 找出最佳的试剂加入量、酸度、温度和显色时间，使样品和标准在尽可能完全相同的条件找出最佳的试剂加入量、酸度、温度和显色时间，使样品和标准在尽可能完全相同的条件 下测定下测定 p 通过加掩蔽剂和控制通过加掩蔽剂和控制pH值，清除共存离子的干扰，值，清除共存离子的干扰，例如检测氨氮时加入酒石酸钾钠，可掩例如检测氨氮时加入酒石酸钾钠，可掩 蔽水中常见的钙、镁、铁等离子在测定过程中生成沉淀蔽水中常见的钙、镁、铁等离子在测定过程中生成沉淀 p 吸光度吸光度0.11.0，最好，最好0.10.7范围内测定范

8、围内测定 对对A0.1的溶液，吸收池厚度大一些，或萃取浓缩来提高的溶液，吸收池厚度大一些，或萃取浓缩来提高A 对对A1.0的溶液，可稀释或用薄的吸收池来降低的溶液，可稀释或用薄的吸收池来降低A p 减小仪器误差减小仪器误差 稳压器稳压器入射光强度保持不变入射光强度保持不变 仪器的单色器分光性好仪器的单色器分光性好较纯的单色光较纯的单色光 吸收池厚度一致，套与套之间不搞错吸收池厚度一致，套与套之间不搞错 透光性能好（指纹、油腻、沉淀物、颜色渗透）透光性能好（指纹、油腻、沉淀物、颜色渗透） 影响检测的因素及减小误差的方法影响检测的因素及减小误差的方法 尽量尽量减少开关次数减少开关次数，刚关闭的光源

9、等不要立即重新开启，刚关闭的光源等不要立即重新开启 若光源灯亮度明显减弱或不稳定，应若光源灯亮度明显减弱或不稳定，应及时更换新灯及时更换新灯 经常经常更换单色器盒的干燥剂更换单色器盒的干燥剂，防止色散元件受潮生霉，防止色散元件受潮生霉 选择波长应选择波长应平稳的转动平稳的转动，不可用力过猛，不可用力过猛 比色皿的比色皿的光学面应保持清洁光学面应保持清洁，保证检测数据的准确性，保证检测数据的准确性 实验室电压波动较大时，需配备有过压保护器的稳压器实验室电压波动较大时，需配备有过压保护器的稳压器 停止工作时，必须切断电源，盖上防尘罩；仪器若长期不用，要定期通电停止工作时，必须切断电源，盖上防尘罩；

10、仪器若长期不用，要定期通电2030 min 定期对分光光度计进行校验（包括波长准确度、透射比正确度、稳定度）定期对分光光度计进行校验（包括波长准确度、透射比正确度、稳定度） 分光光度计的维护保养要坚持分光光度计的维护保养要坚持“三防四定三防四定”制度，做到制度，做到防尘、防防尘、防 潮、防振潮、防振和和定人保管、定点存放、定期维护、定期检修定人保管、定点存放、定期维护、定期检修 紫外紫外-可见分光光度计的日常保养可见分光光度计的日常保养 2 紫外紫外-可见分光光度计的应用可见分光光度计的应用 通过详细课题讲解该仪器的具体应用及研究课题的思路通过详细课题讲解该仪器的具体应用及研究课题的思路 分光

11、光度法检测甲醛的方法研究分光光度法检测甲醛的方法研究 通过查阅相关文献，得出可采用通过查阅相关文献，得出可采用 分光光度法的检测方法包括变色酸法、分光光度法的检测方法包括变色酸法、 盐酸苯肼法、乙酰丙酮法以及间苯三盐酸苯肼法、乙酰丙酮法以及间苯三 酚法等。此课题是对所有方法的反应酚法等。此课题是对所有方法的反应 条件进行研究，进而得出更佳的反应条件进行研究，进而得出更佳的反应 条件及各类方法的对比。在此，以其条件及各类方法的对比。在此，以其 中变色酸法进行仪器应用的相关讲解。中变色酸法进行仪器应用的相关讲解。 显色剂的显色剂的 选择选择 生成物最生成物最 大吸收波大吸收波 长的确定长的确定 反

12、应中单反应中单 因素的条因素的条 件选择件选择 正交试验正交试验 得出最佳得出最佳 反应条件反应条件 验证结论验证结论 方法的回方法的回 收率与精收率与精 密度密度 方法的研究思路方法的研究思路 显色剂的选择显色剂的选择 通过查阅相关文献得知，甲醛与变色酸在浓硫酸介质中反应生成紫色化合物，通过查阅相关文献得知，甲醛与变色酸在浓硫酸介质中反应生成紫色化合物， 该化合物在可见光波段有吸收，且在一定时间内，化合物相对较稳定，可采用分光该化合物在可见光波段有吸收，且在一定时间内，化合物相对较稳定，可采用分光 光度法进行检测。光度法进行检测。 生成物最大吸收波长的确定生成物最大吸收波长的确定 在在10

13、mL比色管中比色管中,加入加入3.0 mL变色酸溶液变色酸溶液, 再缓缓加入浓硫酸再缓缓加入浓硫酸6.0 mL,冷却后加冷却后加 入入2.0 mL甲醛标准使用液，甲醛标准使用液，95 水浴水浴30 min ,然后进行然后进行400800 nm全波段扫描全波段扫描， 测其测其最大吸收波长最大吸收波长。 结论结论 反应生成的紫色化合物在反应生成的紫色化合物在572 nm处处 有最大吸收，因此本试验采用的最大吸收有最大吸收，因此本试验采用的最大吸收 波长为波长为572 nm。 反应中单因素的条件选择反应中单因素的条件选择 根据反应原理，本试验共选取根据反应原理，本试验共选取3个因素，变色酸和浓硫酸的

14、体积比、水浴时间、个因素，变色酸和浓硫酸的体积比、水浴时间、 水浴温度，并分别进行水浴温度，并分别进行单因素试验单因素试验（即固定其中两个因素，只改变第三个因素的试即固定其中两个因素，只改变第三个因素的试 验），各自选择吸光度较大的三个反应条件作为正交试验的因素。验），各自选择吸光度较大的三个反应条件作为正交试验的因素。 结论结论 通过单因素试验，选择如下正交试验因素通过单因素试验，选择如下正交试验因素 变色酸和浓硫酸的体积比：变色酸和浓硫酸的体积比：2:6 3:5 4:4 水浴时间：水浴时间：6 min 8 min 10 min 水浴温度：水浴温度：75 85 95 正交试验得出最佳反应条件

15、正交试验得出最佳反应条件 正交试验是研究正交试验是研究多因素多水平多因素多水平的一种设计方法，是根据正交性从全面试验中挑的一种设计方法，是根据正交性从全面试验中挑 选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比均匀分散，齐整可比” 的特点。例如，作一个三因素三水平的实验，按全面实验要求，须进行的特点。例如，作一个三因素三水平的实验，按全面实验要求，须进行3*3=27种组种组 合的实验，若合的实验，若按正交表安排实验按正交表安排实验，只需作，只需作9次，显然大大减少了工作量次，显然大大减少了工作量，因而正交实因而正交实

16、 验设计在很多领域的研究中已经得到广泛应用。验设计在很多领域的研究中已经得到广泛应用。 反应中单因素的条件选择反应中单因素的条件选择 比较本试验比较本试验A、B、C个因素个因素K值的大小，可以得出最优值的大小，可以得出最优 条件是条件是A2B1C3 ，即，即3.0 mL变色酸溶液、变色酸溶液、5.0 mL浓硫酸，浓硫酸，95 水浴水浴6 min。观察表中中。观察表中中A、B、C个因素中极差个因素中极差R的大小，的大小， RA远远大于远远大于RB和和RC，说明变色酸和浓硫酸的体积比是影响，说明变色酸和浓硫酸的体积比是影响 该试验的主要因素，其次是水浴温度，最后是水浴时间。同该试验的主要因素，其次

17、是水浴温度，最后是水浴时间。同 时对比水浴时间和空白列的时对比水浴时间和空白列的R的大小，二者数值接近，这表明的大小，二者数值接近，这表明 水浴时间在水浴时间在6 min10 min之内的变化对试验的结果影响非常之内的变化对试验的结果影响非常 小，可以忽略不计，这就大大降低了试验中对水浴时间的操小，可以忽略不计，这就大大降低了试验中对水浴时间的操 作要求。在水浴时间方面，作要求。在水浴时间方面，6 min时不但其时不但其K值最大，而且由值最大，而且由 于于6 min10 min内对试验结果影响很小，所以最终确定水浴内对试验结果影响很小，所以最终确定水浴 时间为时间为6 min。 序列 V(变色

18、酸mL):V(浓硫酸 mL)A 水浴时间 （min）B 水浴温度（） C 空白吸光值 12：6（A1）6(B1)75(C1) 0.938 22：6（A1）8(B2)85(C2) 1.077 32：6（A1）10(B3)95(C3) 1.175 43：5（A2）6(B1)85(C2) 1.082 53：5（A2）8(B2)95(C3) 1.150 63：5（A2）10(B3)75(C1) 0.986 74：4（A3）6(B1)95(C3) 0.620 84：4（A3）8(B2)75(C1) 0.168 94：4（A3）10(B3)85(C2) 0.455 K11.0630.8800.6970.8

19、47 K21.0720.7980.8710.894 K30.4140.8720.9810.808 R0.6580.0820.2840.086 验证结论验证结论 当由正交试验分析得出的最佳反应条件并未出现在设置中，则需要进行验证试当由正交试验分析得出的最佳反应条件并未出现在设置中，则需要进行验证试 验验。将最佳反应条件下的试验结果与正交表中出现的组合条件的最大吸光值进行对。将最佳反应条件下的试验结果与正交表中出现的组合条件的最大吸光值进行对 比，若前者比后者的吸光值要大，则验证成功，然后进行标准曲线的绘制。比，若前者比后者的吸光值要大，则验证成功，然后进行标准曲线的绘制。 TIP 绘制标准曲线时

20、，通常至少需要绘制标准曲线时，通常至少需要5个点，亦可个点，亦可 增加到增加到7个点。建议在配置标准溶液时，选择个点。建议在配置标准溶液时，选择10个个 不同浓度的标准，在绘制曲线时，若相关系数较低，不同浓度的标准，在绘制曲线时，若相关系数较低， 可剔除其中偏差较大的点，用以提高相关系数。可剔除其中偏差较大的点，用以提高相关系数。 方法的回收率与精密度方法的回收率与精密度 按照结论进行方法的回收率和精密度的测定，当样品中甲醛的添加水平为按照结论进行方法的回收率和精密度的测定，当样品中甲醛的添加水平为0.55 mg/Kg时，回收率为时，回收率为75.5 %102.0 %，相对标，相对标 准偏差为

21、准偏差为9.2 %11.3 %，添加水平为，添加水平为1.10 mg/Kg时，回收率为时，回收率为79.7 %108.6 %，相对标准偏差为，相对标准偏差为8.4 %9.1 %，添加水平为，添加水平为2.20 mg/Kg时，回收率为时，回收率为80.1 %106.8 %，相对标准偏差为，相对标准偏差为7.0 %8.7 %。在三个不同浓度的添加水平下，回收率为。在三个不同浓度的添加水平下，回收率为75.5 %108.6 %， 相对标准偏差为相对标准偏差为7.0 %11.3 %，说明该方法的准确度和重现性均为良好。，说明该方法的准确度和重现性均为良好。 测量方法确认技术分正确度试验（标准物质分析试验、测量方法确认技术分正确度试验（标准物质分析试验、回收率回收率试验、不同方法的比对试验）、试验、不同方法的比对试验）、精密度精密度试验（室内重复试验（室内重复 性、中间精密度、协同试验、极差试验）、性、中间精密度、协同试验、极差试验）、检出限检出限的确定、的确定、测量范