植病研究法---植物线虫病害研究技术

1、植物线虫病害研究技术 主讲人：吴彩兰主讲人：吴彩兰 植物线虫病害研究技术 v第一节 植物寄生线虫的采集 v第二节 线虫的分离 v第三节 线虫玻片标本的制作 v第四节 线虫的培养 v第五节 线虫的接种 第一节 植物寄生线虫的采集 1.1.线虫病的症状线虫病的症状 植物受到线虫为害后，可以表现各种症状。有的表现为瘿瘤、叶斑、植物受到线虫为害后，可以表现各种症状。有的表现为瘿瘤、叶斑、 坏死或整株枯死等，通常可以在病变部位找到病原线虫。但是多数线虫坏死或整株枯死等，通常可以在病变部位找到病原线虫。但是多数线虫 病表现为变色、褪绿、黄化、矮缩和蔫萎等症状，这多半是根部受害造病表现为变色、褪绿、黄化、矮

2、缩和蔫萎等症状，这多半是根部受害造 成的。成的。大多数病原线虫并不在地上部，往往在根部或根际的土壤中可以大多数病原线虫并不在地上部，往往在根部或根际的土壤中可以 找到。找到。后一种类型的线虫病，在施肥或采取其他措施以后，植株的长势后一种类型的线虫病，在施肥或采取其他措施以后，植株的长势 可以暂时恢复，但不久又表现出原来的受害状。这类线虫病的危害性往可以暂时恢复，但不久又表现出原来的受害状。这类线虫病的危害性往 往容易忽视。往容易忽视。 v植物的腐烂组织中，尤其是地下部分的器官，也常常发现有线虫，这就要注意区 别是腐生线虫还是寄生线虫。腐生性线虫的主要特征是在水中十分活跃，口腔内 没有吻针，食道

3、多为双胃型或小杆型，尾部很长，多为丝状。植物寄生线虫通常 都有发达的口针，尾部较短、尖削或钝圆。 v各属线虫的为害状不同：（1）茎线虫（Ditylenchus）主要为害植物的地下茎， 如块茎、鳞茎和块根等；（2）胞囊线虫（Heterodera）多寄生在植物根部支根 或须根的侧面，虫体裸露；（3）根结线虫（Meloidogyne）在新生的支根或侧 根上寄生后引起根结，虫体在瘤状组织中；粒线虫(Anguina）和滑刃线虫 （Aphelenchoides）主要为害植物的地上部分，虫体则常在茎杆的生长点或穗部； 可以传染植物病毒病的长针线虫（Longidorus )、剑线虫（Xiphinema)和毛刺

4、线 虫（Trichodorus）等，在根部外寄生，在土中十分活跃，虫体较大，而且都有 发达的口针。伞滑刃线虫（Bursapheleuchus）中的松材线虫主要为害松树枝干 的木质部。 2 2. . 标本的采集标本的采集 （1）病变组织的采集 植物受线虫为害后，发生明显病变的部位，往往也是病原 线虫存在的部位。例如，小麦粒线虫（Anguina tritici）在籽 粒虫瘿中，水稻干尖线虫（Aphelenchoides besseyi ）在穗 部籽粒颖壳的内侧，根结线虫和胞囊线虫等都在根部，茎线 虫则多在地下茎部。只要采集病变的组织器官，就能得到病 原线虫。 （2 2）病根、根际土壤和大田土样的采

5、集）病根、根际土壤和大田土样的采集 对于在根部内寄生的线虫，采取根样是很重要的；而对于在根部外营 寄生生活的线虫，则土样尤为重要。由于线虫世代的交替与重叠，内寄生 线虫也有一段时期生活在土壤中，外寄生线虫在某一时期则在根部取食寄 生，因此取样时应把根系和根际土壤一起采集。 绝大多数线虫分布在耕作层中，所以都是在0-20cm的土层中采集土样。 采集土样最好在湿润的土壤中采，过于干燥和潮湿的土壤，其中线虫的存 活率低。因此，土样的采集最好是用特殊的采样器，有的是半筒状的，长 20- 30cm，宽20-25mm。 （3）样本的保存 采采到的标本或土样要防止干燥，写好标签后随即放在聚乙到的标本或土样要

6、防止干燥，写好标签后随即放在聚乙 烯薄膜袋中。不要用有色的或有气味的薄膜口袋，袋口要用烯薄膜袋中。不要用有色的或有气味的薄膜口袋，袋口要用 橡皮筋扎紧。橡皮筋扎紧。根系或土壤样本，放在冰箱中（根系或土壤样本，放在冰箱中（4)4)，可保存，可保存 一定时期而不致损坏。一定时期而不致损坏。一般都在一般都在5-105-10温度下贮存。贮藏最温度下贮存。贮藏最 适宜的温度对各种线虫是不同的，在适宜的温度对各种线虫是不同的，在5-205-20之间，但之间，但1313时时 多数线虫都是能活动的。多数线虫都是能活动的。 第二节 线虫的分离 1 1植物材料中线虫的分离植物材料中线虫的分离 （1）直接观察分离法

7、）直接观察分离法 胞囊线虫、根结线虫等根部寄生的线虫，可在解剖镜下用挑 针直接挑取虫体观察。对于一些虫体较大的线虫，如茎线虫 和粒线虫等，可在解剖镜下用尖细的竹针或毛针将线虫从病 组织中挑出，放在凹穴玻片上的水滴中，作进一步的观察和 处理。 （2）漏斗分离法 漏斗分离（Baermann）操作简便，是目前从植物材料中分 离线虫比较好的方法。将带有线虫的植物组织浸在水中，短 时间内在水中检查不到线虫；必须经过较长的时间，线虫离 开组织而游离到水中，才能从水中收集到线虫。漏斗分离法 是使游离到水中的线虫，沉集在漏斗的底部。它的装置是将 玻璃漏斗（直径为10-15cm），架在铁架上，下面接一段 （10

8、cm左右）橡皮管，橡皮管上装一个弹簧夹。 v植物材料切碎后用纱布包好，放在盛满清水的漏斗中。经过4-24h，由于 趋水性和本身的重量，线虫就离开植物组织，并在水中游动，最后都沉 降到漏斗底部的橡皮管中。打开弹簧夹，取底部约5ml的水样，其中含有 样本中大部分活动的线虫。 v漏斗分离法也适用于分离土壤中的线虫。方法是在漏斗的筛网上放一层 细纱布或多孔疏松的纸（如市售雪花牌卫生纸），上面加一薄层土壤样 本，加水后放置过夜。这种方法适用于分离活动性较大的线虫，如茎线 虫、短体线虫（Pratylenchus）以及根结线虫和胞囊线虫的2龄幼虫。如 果温度和时间控制得好，线虫的回收率比较稳定。 （3）培育

9、分离法 直接用漏斗分离法不容易分离到的线虫，可先将根部的土 粒轻轻洗去，立即放在螺旋盖的玻瓶中，加清水几毫升，盖 不要旋紧，在室温下（20-25）放3-5d，再加50m1的清水， 盖紧并轻轻振荡，顺序用20-40目、200-250目、325目的网 筛，轻轻地用清水冲洗，直接观察后两个筛上残留物中的线 虫。或者将残留物取出，再经过漏斗法分离。瓶内的根还可 加水继续培育，根据不同植物材料在5d到4周内可不断分离 到线虫。细菌和真菌的污染，是长期培育中存在的问题。 （4）组织捣碎分离法 取根组织约5g左右，切成1-2cm长的小段，加水80-100ml， 用组织捣碎机高速处理20s。处理的时间和速度，

10、根据不同 的材料，经过实验决定。将捣碎液顺序通过20-40目、200- 250目、325目的网筛，用清水轻轻冲洗，直接观察后两个 筛上残留物中的线虫，或者将残留物取出，再用漏斗法分离。 短体线虫和穿刺线虫的幼虫和成虫，用这种方法分离不致被 损伤，但根结线虫的雌虫则大都被捣碎。 2. 土样中线虫的分离 土壤线虫的分离，除去漏斗分离法外，一般都是用不同孔径的网筛，将线 虫筛选出来。土壤线虫的各种分离法的设计，是根据线虫的体形细长、有 活动能力、趋水性和虫体有一定的重量等性状，但几乎所有的方法都要经 过过筛这一步。 (1) 直接过筛法 过筛线虫的筛子一套有7个，其网目数分别为16 (20)，25，5

11、0，100， 160 (200)，250和325 (400)。过筛时不是每次都要用整套的筛子，最常用 的是20目、100目、200目和325目的4个。 筛网多为黄铜丝或磷青铜丝的，也可以用尼龙丝网。筛子的直径是10- 28cm。分离时先将土样充分混和均匀，取250g放在小铝桶或塑料桶内。 加水约700-1000ml,用力搅动使土块分散，沉降10s后，将上面的悬浮液通 过20网目的筛子倒在第二个小桶内。网筛上的残余物和第一个桶底的泥砂 用水冲洗后弃去。 按照上述步骤，顺序用100，200和325网目的网筛处理后，3个筛上的残 余物分别洗在3个容量约250m1的烧杯中，然后取样检查和记数。用325

12、网 目筛子过筛时，要尽量洗去细小的粘土颗粒，但注意不要把线虫冲掉。 （2）线虫滤纸分离法 这种方法适用于分离土样中活动能力强和趋水性强的线虫，尤其是一 些大型的线虫，如剑线虫、毛刺线虫和长针线虫等；对活动能力很差的 或不活动的线虫是不适用的。线虫滤纸是特制的，其成分是棉花和人造 纤维的混合物，浸水后膨胀，质地疏松并有较大的孔隙，线虫可以穿过 滤纸，而泥砂颗粒则阻留在纸上。 取土样约50g，放在第一个搪瓷杯中，加水500m1浸泡，搅拌15min， 静置l0s，将上层悬浮液倒在第二个搪瓷杯中。土样中再加水500ml，再 次搅拌并静置后，将上层悬浮液也倒在第二个杯中。将铺有线虫滤纸的 小筛放在浅盘中

13、，然后将搅拌并静置10s后的悬浮液倒在小筛中。为了 防止倒悬浮液时冲破滤纸，滤纸上可放表面皿，使水向四周慢慢溢出流 到滤纸上。悬浮液倒完后，用清水仔细冲洗滤纸，待浑水全部滤出后， 取出小筛，放在稍大一些的筛中，然后放在盛有清水的浅盘中，水的深 度以刚好浸没滤纸为度。浅盘放在冷凉处过夜，第二天取出筛子，线虫 则留在水中，将水用吸管吸在培养皿或计数皿中观察。为了防止细菌或 霉菌的生长，水中可加少量的杀菌剂，如0.05的链霉素或乙氧基乙基 氯化汞溶液。 （3）沉降分离法 沉降分离法（Seinhorst方法）的设备很简单，只要容量1L 的三角瓶和烧杯各2个。这种方法回收线虫的效率较高，一 般可达75以

14、上。 （4）漂浮淘析法 （5）漂浮分离法 v3分离到的线虫的活体检查 v一般光学显微镜可以观察线虫的一般形态和结构，但是为了检查较微细 的结构特征，可以用相差显微镜和干涉显微镜，使结构表现出明显的差 别，可以看得更清楚一些。 v活体镜检有其优点，容易看清线虫中某些结构。若用麻醉剂处理使其停 止活动，更有利于观察。叠氮化钠（(sodium azide)的0.01mol/L溶液对 许多线虫是非常有效的，处理后几分钟内即停止活动，用清水洗后1h左 右即恢复活动。二氧化碳是麻醉蚜虫常用的方法，也适用于线虫。方法 是将线虫放在玻片的水滴中，边上放一些干冰，再用烧杯覆盖。比较简 单的方法是在50ml水中加

15、2滴二氯乙醚，也有加氯仿的。为了使线虫的 口针伸出便于观察，可用稀释的氨水（0.30.4mol /L )，二三滴加在有 凹陷的载玻片上，将要观察的线虫挑入水滴中，1-2min后，口针即伸出， 必要时还可加滴氨水。但口针的伸出是暂时的，为便于进一步制片或进 行扫描电镜观察，可以立即用碘液杀死线虫。 第五节 线虫的接种 v为了证明一种线虫的致病性，必须通过接种实验。各种类型线虫病的接 种方法不同，同时如要证明线虫能传染其他病害，还要与其他病原生物 混合接种。 v1、线虫的单独接种 v（1） 带虫材料的混播混栽法 v由种苗传播的线虫病，一般可采用带虫材料混播混栽的方法接种。如小 麦粒线虫的接种，是将虫瘿与麦种混播；甘薯或马铃薯茎线虫，可用混 插混栽接种。 v胞囊或根结线虫的接种，可采用大田混播法，也可在温室或温床中接种。 方法是先在床底铺好湿砂，厚约20cm，砂中混有20的线虫胞囊；在播 种沟内也填上线虫和湿砂的混合物，厚约lcm。播种后盖以细砂或木屑， 保温保湿，植株生长过程中就被胞囊或根结线虫侵染。 （2）喷雾接种法 为害幼芽或叶片的线虫，可以将线虫悬浮液用滴注或喷雾 的方法接种。 （3）伤口接种法 在健组织上钻几个小孔，将带有线虫的材料埋在孔中，或 者用培养的线虫悬浮液灌注或注射到孔内。伤口用脱脂棉保 湿，也可用熔化的蜡或原来钻下