现代分子诊断技术

1、第七章第七章 现代分子诊断技术现代分子诊断技术 v酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附测定 vDNADNA诊断系统诊断系统 vDNADNA指纹指纹 v遗传性疾病的分子诊断技术遗传性疾病的分子诊断技术 基因诊断基因诊断 基因基因蛋白质蛋白质 性状性状 生化生化 诊断诊断 基因基因 诊断诊断 临床临床 诊断诊断 v传统的诊断程序传统的诊断程序 先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的 生理学特性生理学特性 确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌， 还是其他物质还是其他物质 实践证明实践证明: :比较有效比较有效, ,检测到

2、病原微生物相对比检测到病原微生物相对比 较特异较特异 诊断成本高、速度慢、效率低诊断成本高、速度慢、效率低 如砂眼衣原体、朊病毒如砂眼衣原体、朊病毒 方法方法优点优点缺点缺点 显微镜镜检显微镜镜检简单易行，可直接观察到简单易行，可直接观察到 寄生虫的形态寄生虫的形态 速度慢，灵敏度低，对经速度慢，灵敏度低，对经 验水平要求高费时费工，验水平要求高费时费工， 无法辨别形态相近的寄生无法辨别形态相近的寄生 虫虫 体外培养、接种体外培养、接种能检测到活的寄生虫，并能检测到活的寄生虫，并 可检测感染性和感染程度可检测感染性和感染程度 速度慢、花费高，寄生虫速度慢、花费高，寄生虫 可能难以进行体外培养，

3、可能难以进行体外培养， 且必须使用动物材料且必须使用动物材料 抗体检测抗体检测简单、快速、能够实现自简单、快速、能够实现自 动化，可用于检测大量的动化，可用于检测大量的 样品样品 无法区分活的寄生虫与处无法区分活的寄生虫与处 在潜伏状态的寄生虫。有在潜伏状态的寄生虫。有 时会有非特异反应发生时会有非特异反应发生 DNADNA杂交及杂交及PCRPCR快速灵敏，能够实现自动快速灵敏，能够实现自动 化，可以分辨不同种的寄化，可以分辨不同种的寄 生虫，不需要以前有寄生生虫，不需要以前有寄生 虫感染病史虫感染病史 花费高，步骤多，无法区花费高，步骤多，无法区 分活的和死的寄生虫，有分活的和死的寄生虫，有

4、 时会有假阳性或假阴性时会有假阳性或假阴性 检测寄生虫感染的诊断方法的比较 v现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分 子生物学的方法对病原物质进行诊断检测子生物学的方法对病原物质进行诊断检测 v一种有效的诊断方法应具备：一种有效的诊断方法应具备： 1 1、专一性（、专一性（specificityspecificity）强，诊断只对某一种病原菌分）强，诊断只对某一种病原菌分 子产生阳性反应子产生阳性反应 2 2、灵敏度、灵敏度(sensitivity)(sensitivity)高高 3 3、操作简单、操作简单(simplicity)(simplicity)

5、基因诊断的特点基因诊断的特点 v特异性高特异性高 检测目标是基因，为原始的致病因素检测目标是基因，为原始的致病因素 v灵敏度高灵敏度高 待测标本往往微量，目的基因只需待测标本往往微量，目的基因只需pg水平水平 v稳定性高稳定性高 基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需 处于活性状态处于活性状态 v诊断范围广，适应性强诊断范围广，适应性强 确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态 v临床应用前景好临床应用前景好 基因诊断优点基因诊断优点 v从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制 v

6、显著提早产前诊断的时间显著提早产前诊断的时间 v无需对组织、器官或细胞进行选择无需对组织、器官或细胞进行选择 v快捷准确、安全快捷准确、安全 基因诊断常用的技术基因诊断常用的技术 核酸分子杂交核酸分子杂交 PCRPCR（聚合酶链式反应）（聚合酶链式反应） 限制性酶切分析限制性酶切分析 SSCPSSCP（单链构象多态性分析）（单链构象多态性分析） DNADNA 测序测序 DNADNA 芯片技术芯片技术 vDNADNA Southern blot, FISH,PCR, Sequencing, Southern blot, FISH,PCR, Sequencing, micoarray, restr

7、iction analysis, RFLPmicoarray, restriction analysis, RFLP，SSCPSSCP vRNARNA Northern blot, RT-PCR, micoarrays Northern blot, RT-PCR, micoarrays vProteinProtein Western blot, Immuno-histochemistry, Western blot, Immuno-histochemistry, microarray microarray Southern blot N N T T N T T FISH PCR 技术技术 DN

8、ADNA 测测 序序 指在固相支持物上指在固相支持物上原位合成寡核苷酸原位合成寡核苷酸或者直接将或者直接将 大量探针以显微打印的方式有序地固化大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，于支持物表面， 然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得 出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息） 由于在制备过程中运用了由于在制备过程中运用了计算机芯片计算机芯片的制备技术的制备技术 如显微光蚀刻、显微打印等，且常用如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片硅芯片作为固相作为固相 支持物，所以称为支持物，所以称为DNA

9、DNA芯片技术芯片技术 DNADNA芯片技术的概念芯片技术的概念 DNADNA芯片技术原理芯片技术原理 v大规模集成的固相杂交大规模集成的固相杂交 v基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA 双链碱基互补配对、变性和复性的原理 以大量已知序列的寡核苷酸、以大量已知序列的寡核苷酸、 cDNAcDNA或基因片段作探针，检测或基因片段作探针，检测 样品中哪些核酸序列与其互补，样品中哪些核酸序列与其互补， 然后通过定性、定量分析得出待然后通过定性、定量分析得出待 测样品的基因序列及表达的信息测样品的基因序列及表达的信息 DNA芯片技术流程 Biological Sample Analyze dataSca

10、nner microarray “Hybridize” arrayer vMicroarray fabrication vSample preparation vMolecular hybridization vDetection and analysis 基因诊断的原理基因诊断的原理 v利用分子生物学和分子遗传学的技术，从利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNADNA或或RNARNA 水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从 而对疾病做出诊断的方法而对疾病做出诊断的方法 v策略策略 检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因检测已知的能产生某种特

11、定功能蛋白的基因 检测与某种遗传标志连锁的的致病基因检测与某种遗传标志连锁的的致病基因 检测表型克隆基因检测表型克隆基因 基因治疗的机理基因治疗的机理 v 基因置换：正常基因取代致病基因基因置换：正常基因取代致病基因 v 基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列 v 基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因的功能基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因的功能 v 基因抑制：外源基因干扰、抑制有害基因的表达基因抑制：外源基因干扰、抑制有害基因的表达 v 基因封闭：封闭特定基因的表达基因封闭：封闭特定基因的表达 v “ “自杀基因自杀基因”的应用的应用 v 免疫基因的治

12、疗免疫基因的治疗 v 耐药基因的治疗耐药基因的治疗 美国医学家美国医学家W F 安德森等人对腺甘脱氨安德森等人对腺甘脱氨 酶缺乏症（酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是缺乏症）的基因治疗，是 世界上第一个基因治疗成功的范例世界上第一个基因治疗成功的范例 谢德尔，谢德尔，1999 n 分子诊断分子诊断 l 利用利用PCRPCR技术或技术或 PCRPCR与分子杂交与分子杂交 标记相结合，可标记相结合，可 以快速准确地检以快速准确地检 测出病原性物质。测出病原性物质。 n 分子诊断分子诊断 羊水和胎盘绒毛膜检测 第一节酶联免疫吸附测定第一节酶联免疫吸附测定 v抗体高度特异地与抗原分子结合抗体高度特

13、异地与抗原分子结合 v通过抗原通过抗原-抗体的特异识别反应进行检测抗体的特异识别反应进行检测 酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附测定(enzyme-linked (enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)immunosorbant assay,ELISA) 一、酶联免疫吸附测定的原理一、酶联免疫吸附测定的原理 工作原理：工作原理： v主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合 v假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于 检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然检测的抗体，则首先需要

14、纯化出这种蛋白质，然 后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在 免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体 二、检测过程：二、检测过程： 将待测样品结合在固相支持物（如将待测样品结合在固相支持物（如9696孔的微量滴定孔的微量滴定 板）上板）上 加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗 （primary antibodyprimary antibody）, ,反应后冲洗，将未结合上的反应后冲洗，将未结合上的 一抗洗去一抗洗去 加入二抗（加入二抗（secondary antibo

15、dysecondary antibody），二抗通常只特），二抗通常只特 异地识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着异地识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着 一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这 些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有 色物质），一抗与二抗反应完成后，再次冲洗将未色物质），一抗与二抗反应完成后，再次冲洗将未 与一抗结合的二抗洗去与一抗结合的二抗洗去 加入无色底物加入无色底物 双抗体夹心法双抗体夹心法 v检测大分子抗原检测大分子抗原 间接法间接法 v检测抗体检测抗体 竞争法

16、竞争法 v测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体 双夹心法双夹心法 v测定大分子抗原测定大分子抗原 特异性相同，来源不同特异性相同，来源不同 3、使用多克隆抗体的缺点、使用多克隆抗体的缺点 同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备 的抗体的量之间也会有差异的抗体的量之间也会有差异 无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之 间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分，间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分， 因为在因为在

17、ELISA检测中都会发生颜色变化检测中都会发生颜色变化 v单克隆抗体特异性强单克隆抗体特异性强 只结合抗原上某一单一位置只结合抗原上某一单一位置 4、酶联免疫吸附测定的局限性、酶联免疫吸附测定的局限性 v仅凭仅凭ELISAELISA结果容易造成误诊，结果容易造成误诊，ELISAELISA检测只能作检测只能作 为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进 行行westernwestern检测检测 v要提高要提高ELISAELISA检测的准确度检测的准确度, ,就必须提高一抗的特就必须提高一抗的特 异性异性 v在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位在使用

18、抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位 点的点的基因要表达，基因要表达，而且目标位点而且目标位点不能够以任何方不能够以任何方 式被覆盖或阻断式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结否则都将影响抗体与抗原的结 合合 第二节第二节 DNA诊断系统诊断系统 vDNA诊断的理论基础：诊断的理论基础：任何一个决定生物学任何一个决定生物学 特性的特性的DNADNA序列都应该是独特的，都可以作序列都应该是独特的，都可以作 为专一性的诊断标记为专一性的诊断标记 一、核酸杂交一、核酸杂交 1、工作原理：、工作原理： 两条两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成链之间可以通过碱基配对而形成 氢键氢键 2、3个关键要

19、素：个关键要素： 探针探针DNA 目的目的DNA 信号检测信号检测 主要依据：主要依据： 碱基互补、变性和复性碱基互补、变性和复性 DNA与与DNA杂交：杂交： A=T、 GC ; DNA与与RNA杂交杂交: A=U、 GC ; 变性：变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性：复性： 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补 双链双链 碱基互补碱基互补 核酸分子杂交（固相杂交）操作程序核酸分子杂交（固相杂交）操作程序 制备待测核酸样品制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化分离、变性、转移、固化D

20、NA片段片段 杂交杂交 加入标记核酸探针加入标记核酸探针 检测杂交信号检测杂交信号 标记核酸探针标记核酸探针 预杂交预杂交 制备核酸探针制备核酸探针 漂洗去除未参与杂交的标记探针漂洗去除未参与杂交的标记探针 3、杂交探针、杂交探针 v必须是高度特异性的必须是高度特异性的DNADNA片段片段 v种级探针：区分两个或多个物种种级探针：区分两个或多个物种 v亚种级探针：区分物种内特定的株系亚种级探针：区分物种内特定的株系 vDNADNA vRNARNA v化学合成或克隆的完整基因化学合成或克隆的完整基因 v基因的一个片段基因的一个片段 利用核酸双链的利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的碱基互补、变性

21、和复性的原理，原理， 可以可以用已知碱基序列的单链核酸片段用已知碱基序列的单链核酸片段作为作为探针探针，与待，与待 测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同 源核酸序列的存在源核酸序列的存在 核酸探针核酸探针 是指带有标记的某一特定是指带有标记的某一特定DNA或或RNA片断，能与片断，能与 待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同 源序列源序列 探针标记物探针标记物 有有放射性核素放射性核素或或非放射性核素非放射性核素（生物素、地高辛、（生物素、地高辛、 荧光素等）两大类荧光素等）两大类 v

22、分离杂交探针的方法：分离杂交探针的方法： v提取某一病原微生物株系的染色体提取某一病原微生物株系的染色体DNADNA v限制性内切酶进行酶解限制性内切酶进行酶解 v得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库 1.1.文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性 微生物和非病原性微生物的核微生物和非病原性微生物的核DNADNA进行杂交、筛选进行杂交、筛选 v核酸杂交的灵敏度和可靠性极高核酸杂交的灵敏度和可靠性极高 v用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组 织

23、样品中的目标织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化进行杂交，且无需预先纯化 DNA v若样品中的目标分子非常少，则需通过若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的将目的 序列扩增，再进行杂交检测序列扩增，再进行杂交检测 从理论上讲，用从理论上讲，用DNADNA杂交来诊断疾病可用杂交来诊断疾病可用 于对所有的致病微生物的检测于对所有的致病微生物的检测 4、非同位素标记探针、非同位素标记探针 v 3232P P的缺点： 的缺点： 半衰期短，仅半衰期短，仅1313天天 操作起来比较危险操作起来比较危险 必须要有特殊的实验室设备进行操作必须要有特殊的实验室设备进行操作 放射性垃圾的处理繁琐放

24、射性垃圾的处理繁琐 v非放射性杂交检测系统：非放射性杂交检测系统： 通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学 发光物质而达到放大信号的目的发光物质而达到放大信号的目的 v采用将生物素（采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入）标记的核苷酸掺入DNA的的 方法制备探针方法制备探针 v生物素标记的生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年在室温下至少可保存一年 v检测发光和颜色变化可在几小时内完成检测发光和颜色变化可在几小时内完成 B B B BAP B BAP 生物素生物素 加入链霉素抗生物蛋白加入链霉素抗生物蛋白 加入生物素标记的碱性磷酸酶加入生物

25、素标记的碱性磷酸酶 探针探针 目的目的DNA 加入不同的生色或化学发光底物加入不同的生色或化学发光底物 荧光标记的引物直接进行荧光标记的引物直接进行PCR检测检测 DNA 引物引物1 引物引物2荧光染料荧光染料 PCR 层析层析 荧光检测荧光检测 游离引物游离引物 v分子夹心探针检测分子夹心探针检测 发出荧光发出荧光 分子夹心探针分子夹心探针 (没有荧光没有荧光) 荧光团荧光团猝灭剂猝灭剂 目的目的DNA 与目的与目的DNA杂交杂交 TaqMan探针技术探针技术 v原理：原理： 利用利用Taq酶的酶的3 5外切核酸酶活性，切断探针，外切核酸酶活性，切断探针， 产生荧光信号，由于探针与模板特异性

26、结合，荧光产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合，荧光 的强弱就代表了模板的数量的强弱就代表了模板的数量 3 5 5 3 Q R 上游上游 引物引物 下游下游 引物引物 5 3 3 5 Q R TaqMan探针的荧光信号产生机制探针的荧光信号产生机制 疟疾的分子诊断：疟疾的分子诊断： v检测是否存在疟原虫检测是否存在疟原虫 v抽取血样进行镜检抽取血样进行镜检 v免疫诊断免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体检测疟原虫蛋白或抗体 无法区分是以前感染还是现在感染无法区分是以前感染还是现在感染 1.DNA杂交诊断杂交诊断 例一：例一： vDNADNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的的杂交探针是一

27、段疟原虫的高度重复的DNADNA序列序列 v具体的分离过程：具体的分离过程： v构建一个疟原虫的核基因文库构建一个疟原虫的核基因文库 v用标记的疟原虫核用标记的疟原虫核DNADNA作探针去筛选核基因文库作探针去筛选核基因文库 v选出那些杂交信号最强的克隆选出那些杂交信号最强的克隆 v用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中 不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作 为为DNADNA探针的可靠性探针的可靠性 锥虫的检测锥虫的检测 v锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋

28、巴结、中枢神经 系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞 v显微镜检新鲜血液显微镜检新鲜血液 v取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40,30-40天后天后 杀死昆虫杀死昆虫, ,镜检昆虫的肠道镜检昆虫的肠道 v免疫检测免疫检测: :假阳性高假阳性高 例二：例二： vPCR检测检测 v针对针对锥虫特有的一段锥虫特有的一段188bp的的DNA序列设计序列设计 引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到 188bp的条带的条带 二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技

29、术 v抗生素的不合理使用抗生素的不合理使用 vDNA杂交杂交 vPCR检测检测 v噬菌体介导噬菌体介导 DNA杂交杂交 v设计设计16SrRNA16SrRNA为探针为探针 v16SrRNA16SrRNA在细菌中拷贝数极高，高度的保守性在细菌中拷贝数极高，高度的保守性 v特异性不是很好特异性不是很好 v必须结合必须结合PCRPCR技术技术 PCR检测检测 vnested PCRnested PCR v针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引 物物 每对引物都能特异的扩增出一每对引物都能特异的扩增出一 段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加段目的片段，病原菌存在

30、的可能性大大增加 模板模板 使用外引物，进行第一使用外引物，进行第一 次次PCR扩增扩增 使用内引物，进行第二使用内引物，进行第二 次次PCR扩增扩增 第一次第一次PCRPCR扩扩 增产物增产物 第二次第二次PCRPCR扩扩 增产物增产物 巢式巢式PCRPCR原理示意图原理示意图 vPCR技术也会产生假阳性技术也会产生假阳性 v新扩增的目的新扩增的目的DNADNA特异性不强特异性不强 v退火温度过低退火温度过低 v模板中杂质的污染模板中杂质的污染 v假阴性假阴性 v存在存在TaqTaq酶的抑制剂酶的抑制剂 v模板量过少模板量过少 v模板模板DNADNA纯度不够纯度不够 v原位原位PCR(in

31、situ PCR,ISPCR ) v在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩 增，并通过原位杂交进行检测增，并通过原位杂交进行检测 v不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细 胞中定位胞中定位 原位杂交原位杂交（nucleic acid hybridization in situnucleic acid hybridization in situ） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交， 进而检测特异的进而检测特异的DNADNA或或RNARNA序列序

32、列 细胞原位杂交细胞原位杂交 组织切片原位杂交组织切片原位杂交 DNA-DNADNA-DNA RNA-DNA RNA-DNA 三类杂交三类杂交 RNA-RNARNA-RNA 该法优点：该法优点： 不需提取核酸，不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的故可完整保持组织或细胞的 形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态 有有 噬菌体介导细菌检测噬菌体介导细菌检测 v将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用转将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用转 基因噬菌体去侵染待测样品基因噬菌体去侵染待测样品 v噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在内噬菌体侵

33、染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在内 的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧光素的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧光素 和和ATPATP，就会有荧光产生，就会有荧光产生 v结核菌的检测结核菌的检测 v抗药性菌株的检测抗药性菌株的检测 荧光素酶荧光素酶 荧光素荧光素ATP荧光荧光 利用宿主细胞利用宿主细胞 转录、翻译转录、翻译 噬菌体基因噬菌体基因 荧光素酶荧光素酶 基因基因 宿主细菌宿主细菌 噬菌体介导的细菌检测噬菌体介导的细菌检测 第三节第三节 DNA指纹指纹 v每个人体细胞内都含每个人体细胞内都含 有有23对染色体，每条对染色体，每条 染色体中部含有一个染色体中部含有一个 DNA分

34、子，分子，DNA分子分子 中的核苷酸序列包含中的核苷酸序列包含 着遗传信息，在着遗传信息，在DNA 分子中存在三种类型：分子中存在三种类型： 单拷贝序列、中等程单拷贝序列、中等程 度重复序列、高度重度重复序列、高度重 复序复序 v每个重复序列在每个重复序列在300300个核苷酸长度之内，由于高度重复，序个核苷酸长度之内，由于高度重复，序 列经过超离心后以卫星带出现在主要列经过超离心后以卫星带出现在主要DNADNA带的附近，所以也带的附近，所以也 称卫星称卫星DNADNA，其中的重复序列单元则称为，其中的重复序列单元则称为“小卫星小卫星DNA”DNA” v “ “小卫星小卫星”具有高度的可变性，

35、但在具有高度的可变性，但在“小卫星小卫星DNA “DNA “中有中有 一小段序列则在所有个体中都一样，称为一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列核心序列”。如。如 果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的DNADNA进行进行 分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹 一样具有专一性和特异性，因此称作一样具有专一性和特异性，因此称作“DNADNA指纹指纹” ” v 通过对人类基因组的解析，发现人与人之间通过对人类基因组的解析，发现人与人之间99999999的碱的碱 基序列都相同

36、，而剩下的基序列都相同，而剩下的0.01%0.01%的碱基特征序列则来自于双的碱基特征序列则来自于双 亲，据此可用于亲，据此可用于“亲子鉴定亲子鉴定” 所罗门的审判：所罗门的审判： 大家都听说过所罗门的审判这样一件故事：大家都听说过所罗门的审判这样一件故事： 两位妇人都声称自己是孩子的母亲，于是两位妇人都声称自己是孩子的母亲，于是 所罗门就命令一名侍卫把那个孩子带来，要用剑将其所罗门就命令一名侍卫把那个孩子带来，要用剑将其 辟成两半分给他们两，辟成两半分给他们两， 结果假母亲同意所罗结果假母亲同意所罗 门的判决，而孩子真门的判决，而孩子真 正的母亲却恳求侍卫正的母亲却恳求侍卫 饶了孩子的性命，

37、她饶了孩子的性命，她 解释说：解释说：“把孩子给了把孩子给了 假母亲，总比让孩子假母亲，总比让孩子 惨死好。惨死好。”当然，真假母亲也就水落石出了当然，真假母亲也就水落石出了。 滴骨验亲法：滴骨验亲法： 以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内， 浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有 多种记录。多种记录。 三国时代（公园三国时代（公园220280220280年）谢承著年）谢承著会稽会稽 先贤传先贤传中的中的以弟血滴兄骨以弟血滴兄骨可能是记录此法的可能是记录此法的 最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，

38、当时一最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一 同遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无同遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无 法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将 血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨， 其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。 合血法：合血法： 等到了明代，更是采用了等到了明代，更是采用了“合血法合血法”来识别亲来识别亲 权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：“亲亲 子兄弟或自幼

39、分离，欲相认识。难辨真伪。命各刺子兄弟或自幼分离，欲相认识。难辨真伪。命各刺 出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也。出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也。” 方法：方法： vDNADNA指纹是指对待测样品中的指纹是指对待测样品中的DNADNA进行分析所进行分析所 得到的具有特征性的得到的具有特征性的DNADNA分子杂交图谱分子杂交图谱 vDNA DNA 酶解酶解 电泳电泳 转膜转膜 杂交杂交 v最常用的最常用的DNADNA探针是微卫星序列探针是微卫星序列 受害者血样受害者血样 犯罪嫌疑人犯罪嫌疑人 衣物上血样衣物上血样 犯罪嫌疑犯罪嫌疑 人血样人血样 第四节第四节 遗传性疾病的分子诊断

40、技术遗传性疾病的分子诊断技术 直接诊断直接诊断 点突变点突变 间接诊断间接诊断 多态性连锁分析多态性连锁分析 遗传性疾病的分子诊断技术遗传性疾病的分子诊断技术 vPCR酶解鉴定酶解鉴定 vPCROLA鉴定鉴定 vPCR-ELISA检测检测 vPCR-DGGE鉴定鉴定 v扩增阻滞突变系统（扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS） v连接酶链反应（连接酶链反应（LCR） 镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症(sickle-cell anemia) v典型的单基因遗传性疾病典型的单基因遗传性疾病 v血红蛋白的血红蛋白的链（链（珠蛋白）

41、的第六个氨基酸珠蛋白）的第六个氨基酸Glu发发 生突变成生突变成Val 血红蛋白血红蛋白 - 链上链上 谷氨谷氨 酸酸变成变成缬氨缬氨 酸酸 一、一、PCR酶解鉴定酶解鉴定 v 正常基因为正常基因为CCTGAGGCCTGAGG v镰刀形贫血病患者的基因为镰刀形贫血病患者的基因为CCTGTGGCCTGTGG v限制性内切酶限制性内切酶CvnCvnI I的识别序列为的识别序列为CC TNAGGCC TNAGG v方法方法: v在在CvnCvnI I位点的两点设计两个引物位点的两点设计两个引物; ; v包含包含CvnCvnI I位点区域的位点区域的DNADNA片段通过片段通过PCRPCR扩增扩增 出

42、来出来; ; v扩增的扩增的DNADNA用用CvnCvnI I酶处理，酶解产物用凝胶酶处理，酶解产物用凝胶 电泳分开，经溴化乙锭染色后就可在紫外电泳分开，经溴化乙锭染色后就可在紫外 灯下检查灯下检查DNADNA带型。带型。 382 256 201 181 88 条带大小条带大小(bp)正常纯合子正常纯合子杂合子杂合子突变纯合子突变纯合子 CvuI处理处理 CvuICvuICvuI 256bp 201bp 181bp 88bp CvuICvuI 256bp382bp88bp 正常情况正常情况 镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症 PCR 扩增扩增 引物引物1 引物引物2 PCR产物（长产物（长726

43、bp） 二、二、PCR/OLA鉴定鉴定 vOLA(oligo-nucleotide ligation assay),寡寡 聚核苷酸连接分析聚核苷酸连接分析 v假定一个正常的基因在一个特定的位置发假定一个正常的基因在一个特定的位置发 生了突变，比如说生了突变，比如说150位的位的T突变为突变为G v根据根据150150位两边的序列，人工合成两段短的位两边的序列，人工合成两段短的 核苷酸链，使这两段寡聚核苷酸链与基因核苷酸链，使这两段寡聚核苷酸链与基因 的一条链互补的一条链互补 v探针探针X：寡聚核苷酸链的：寡聚核苷酸链的3端最后一个核苷酸正端最后一个核苷酸正 好与正常基因的好与正常基因的150位

44、的的核苷酸配对位的的核苷酸配对 v探针探针Y：另一段寡聚核苷酸链的：另一段寡聚核苷酸链的5端第一个核苷端第一个核苷 酸与酸与151位的核苷酸配对位的核苷酸配对 正常基因正常基因 探针探针X3端最后一个核苷酸端最后一个核苷酸 就不会与目的基因就不会与目的基因150位位 的核苷酸配对的核苷酸配对 由于由于3最后一个核苷酸不配对而使最后一个核苷酸不配对而使 两个探针无法实现连接两个探针无法实现连接 目的基因突变目的基因突变 两探针与目的基因的两探针与目的基因的 完美配对完美配对 两个探针就可连两个探针就可连 接起来接起来 加入加入DNA 连接酶连接酶 B 150 151 D BD 150 151 B

45、 X Y 150 151 D B D 双链目的双链目的DNA 或或PCR产物产物 热变性热变性 单链目的单链目的DNA 或或PCR产物产物 加探针退火加探针退火 完全配对完全配对 模板有突变模板有突变, 不完全配对不完全配对 连接酶连接酶 连接酶连接酶 加入链霉抗生加入链霉抗生 物素蛋白物素蛋白 加入链霉抗生加入链霉抗生 物素蛋白物素蛋白 BD B 加入碱性磷酸酶加入碱性磷酸酶 加入无色底物加入无色底物 加入碱性磷酸酶加入碱性磷酸酶 加入无色底物加入无色底物 BDAP 变色变色 无色底物无色底物 有色底物有色底物 B 保持无色保持无色 无色底物无色底物 PCR/OLA分析程序示意图分析程序示意

46、图 （1 1）提取）提取DNADNA，热处理成为单链，热处理成为单链DNADNA； （2 2）以单链）以单链DNADNA为模板，仅对可能发生突变的核苷酸区域设计引为模板，仅对可能发生突变的核苷酸区域设计引 物进行物进行PCRPCR扩增后转移到滤膜上，热变性成单链；扩增后转移到滤膜上，热变性成单链； （3 3）分别用两种特异性互补寡核苷酸分子探针（）分别用两种特异性互补寡核苷酸分子探针（ASOASO）杂交。）杂交。 三、三、PCR-ELISA检测检测 v在在PCRPCR反应体系中加入生物素标记的反应体系中加入生物素标记的dUTPdUTP和其和其 他他3 3种种dNTPdNTP v33端经端经DI

47、GDIG标记特异性探针标记特异性探针 v包被有抗生物素抗体的酶标板包被有抗生物素抗体的酶标板 v抗碱性磷酸酶（抗碱性磷酸酶（APAP）DIGDIG抗体抗体 v如果加入的如果加入的DIGDIG标记的探针可与扩增片段结合，标记的探针可与扩增片段结合， 则酶标板上有颜色反应发生，否则不会有颜则酶标板上有颜色反应发生，否则不会有颜 色的变化色的变化 四、四、PCR-DGGEPCR-DGGE法法 v原理原理 变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGEDGGE）是一种根据）是一种根据DNADNA片段片段 的熔解性质而使之分离的凝胶系统的熔解性质而使之分离的凝胶系统 TmTm值主要取决于值主要取决于DNA

48、DNA分子中分子中GCGC含量的多少含量的多少 DGGEDGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度将凝胶设置在双重变性条件下：温度5060 5060 ，变性剂，变性剂0100%0100% 当一双链当一双链DNADNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加片段通过一变性剂浓度呈梯度增加 的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好 相当于此段相当于此段DNADNA的低熔点区的的低熔点区的TmTm值，此区便开始值，此区便开始 熔解，而高熔点区仍为双链熔解，而高熔点区仍为双链 v原理原理 同样长度但序列不同的同样长度但序列不同的DNADNA片段会在胶中不同位片段会在胶中

49、不同位 置处达到各自最低解链区域的解链温度，部分解置处达到各自最低解链区域的解链温度，部分解 链的链的DNADNA片段在胶中的迁移速率急剧降低，形成片段在胶中的迁移速率急剧降低，形成 相互分开的条带图谱相互分开的条带图谱 不同不同DNADNA片段的序列差异发生在最高的解链区域片段的序列差异发生在最高的解链区域 时，这些片段就不能被区分，则人为地加入一个时，这些片段就不能被区分，则人为地加入一个 高熔点区高熔点区GCGC夹，即在一侧引物的夹，即在一侧引物的55端加上端加上 一个一个3040bp3040bp的的GCGC结构，使相应的感兴趣的序列结构，使相应的感兴趣的序列 处于低熔点区而便于分析处于

50、低熔点区而便于分析 突突 变变 型型 野野 生生 型型 杂杂 合合 型型 五、扩增阻滞突变系统五、扩增阻滞突变系统 v等位基因特异性扩增等位基因特异性扩增 v原理原理 TaqTaq缺乏缺乏3 53 5外切酶活性，如果引物外切酶活性，如果引物 的的3 3 端不能与模板端不能与模板DNADNA严格互补配对，模板严格互补配对，模板 DNA DNA 就不能有效的扩增就不能有效的扩增 5 TACATTAGGTT 3 3 TAATCCAA 5 PCR反应继续反应继续 5 TACCTTAGGTT 3 AATCCAA 5 PCR反应终止反应终止 3 T 5 TACATTAGGTT 3 AATCCAA 5 PC

51、R反应终止反应终止 3G 5 TACCTTAGGTT 3 3 GAATCCAA 5 PCR反应继续反应继续 野生型序列野生型序列突变序列突变序列 野野 生生 型型 引引 物物 突突 变变 引引 物物 ARMS原理示意图原理示意图 野生型野生型DNA A T T 3 引物引物3 发红光发红光 C G T 3 引物引物3 无法扩增没有荧光无法扩增没有荧光 A ARMS 检测突检测突 变体举变体举 例例 纯合突变体纯合突变体DNA C G G3 引物引物3 发绿光发绿光 A T G 3 引物引物3 无法扩增没有荧光无法扩增没有荧光 B ARMS 检测突检测突 变体举变体举 例例 杂合突变体杂合突变体

52、DNA A G T 3 引物引物3 G 发黄光发黄光 C ARMS 检测突检测突 变体举变体举 例例 T C 引物引物1 引物引物2 G T 六、连接酶链反应六、连接酶链反应 v基本原理基本原理 利用利用DNADNA连接酶特异地将双链连接酶特异地将双链DNADNA片段连接，经变片段连接，经变 性性- -退火退火- -连接三步骤反复循环，从而使靶基因序连接三步骤反复循环，从而使靶基因序 列大量扩增列大量扩增 设计两对分别互补的引物，引物与之互补的模板设计两对分别互补的引物，引物与之互补的模板 DNADNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相 邻的寡核苷酸引

53、物与靶序列完全互补，邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNADNA连接连接 酶即可连接封闭这一缺口，则酶即可连接封闭这一缺口，则LCRLCR反应的三步骤反应的三步骤 ( (变性变性- -退火退火- -连接连接) )就能反复进行，若连接处的靶就能反复进行，若连接处的靶 序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺 口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不 能进行，也就不能形成连接产物能进行，也就不能形成连接产物 第五节第五节 基因工程疫苗基因工程疫苗 一、疫苗的简介一、疫苗的简介 二、基因工程疫苗二、基因工程疫苗

54、 1、亚单位疫苗、亚单位疫苗 2、肽基疫苗、肽基疫苗 3、DNA疫苗疫苗 一、疫苗的简介一、疫苗的简介 v Dr Edward Jener（1796）：）： 用一种奶牛痘感染人类，感染后不再被天花用一种奶牛痘感染人类，感染后不再被天花 感染感染 v Louis Pasteur （19世纪末）：世纪末）： 研制成功狂犬疫苗研制成功狂犬疫苗 v Von Behring Kitasato Shibasaburo： 开发研制白喉开发研制白喉/破伤风疫苗破伤风疫苗 v医学上最有潜力的防御物质医学上最有潜力的防御物质 v灭活的和减毒的致病物质灭活的和减毒的致病物质 不能丧失引起免疫反应的能力不能丧失引起免

55、疫反应的能力 v麻疹、白喉、百日咳、破伤风、天花、脊髓灰质炎麻疹、白喉、百日咳、破伤风、天花、脊髓灰质炎 传统疫苗的局限性传统疫苗的局限性 有些致病物无法在培养基上生长；有些致病物无法在培养基上生长； 动物和人类的病毒需要在动物细胞中培养；动物和人类的病毒需要在动物细胞中培养； 培养的动物和人类病毒其生长速度和产量一般都很低；培养的动物和人类病毒其生长速度和产量一般都很低； 需要对实验室以及参加实验的操作人员采取特殊的保需要对实验室以及参加实验的操作人员采取特殊的保 护措施；护措施； 疫苗中的致病物质在疫苗生产过程中又可能没有完全疫苗中的致病物质在疫苗生产过程中又可能没有完全 杀死或充分减毒；

56、杀死或充分减毒； 减毒菌株有可能发生突变；减毒菌株有可能发生突变； 有些疾病（如艾滋病）用传统的疫苗防治收效甚微；有些疾病（如艾滋病）用传统的疫苗防治收效甚微； 绝大多数的现行疫苗的有效期短。绝大多数的现行疫苗的有效期短。 衡量疫苗能否投入使用的标准衡量疫苗能否投入使用的标准 v安全性安全性 删除致病基因，保留抗原性。删除致病基因，保留抗原性。 v有效性有效性 尽可能调动机体细胞免疫和体尽可能调动机体细胞免疫和体 液免疫。液免疫。 v免疫系统的工作机制：免疫系统的工作机制：体液免疫、细胞免疫体液免疫、细胞免疫 抗原抗原抗原肽抗原肽细胞表面复合物细胞表面复合物 活化的活化的B 细胞（浆细胞（浆

57、细胞）细胞） 淋巴因子淋巴因子 活化的活化的T细胞细胞 抗体抗体杀灭抗原分子杀灭抗原分子 抗原显示细胞抗原显示细胞 （如树状细胞（如树状细胞） 吞噬，分解吞噬，分解 MHC蛋白质蛋白质 识别、激活识别、激活 杀伤杀伤T细胞细胞 激活释放激活释放 激活激活 分泌分泌 体液免疫体液免疫 细胞免疫细胞免疫 二、基因工程疫苗二、基因工程疫苗 v指用基因工程的方法，表达出病原物的一段指用基因工程的方法，表达出病原物的一段 基因序列，将表达产物（多数是无毒性、无基因序列，将表达产物（多数是无毒性、无 感染能力，但具有较强的免疫原性）用作疫感染能力，但具有较强的免疫原性）用作疫 苗苗 1 1、亚单位疫苗、亚单位疫苗 v 利用病原物的某一部分制得的疫苗利用病原物的某一部分制得的疫苗 v明确编码具有免疫活性的特定抗原的明确编码具有免疫活性的特定抗原的DNADNA，一般选，一般选 择病原体表面糖蛋白编码基因择病原体表面糖蛋白编码基因 v对于易变异的病毒对于易变异的病毒(