试验一蛋白质的变性凝固及沉淀反应

1、实验一 蛋白质的变性、凝固及沉淀反应、蛋白质的加热变性凝固（ 一 ）原理蛋白质受热作用后， 其分子内部结构发生变化， 常使疏水基暴露于表面， 因而失去原有的亲水性质，成为溶解度很低的变性蛋白。蛋白质在其等电点 或等电点附近受热作用，则凝固而沉淀。若在稀酸稀碱中加热，由于变性蛋 白质带正电荷或负电荷，故不易析出，此时如调节到等电点或等电点附近则 沉淀析出，称为结絮。结絮的变性蛋白尚可溶于稀酸或稀碱中。结絮蛋白继天 pH值在等电点或然蛋白加热或等电点附近的溶液中 加酒精凝固蛋白酸性或碱性溶液中加热变性蛋白 调到等电点加热或加酒精结絮蛋白续加热，则成较大的块状凝固蛋白，此时即不再溶于稀酸或稀碱中。（

2、 二 ）操作一、取试管 3 支分别加入10%蛋白液 10滴 + pH4.8缓冲液 10滴10% 蛋白液 10滴 + H20 8滴 + 0.1mol/L HC1 2 滴10% 蛋白液 10滴 + H20 8滴 + 0.1mol/L NaOH 2 滴将上述三管分别混匀，于酒精灯上加热煮沸，观察有何变化。冷却后向管加 0.1mol/L HC1 2 滴观察有何变化 ?为什么 ?向管慢慢滴加 0.05mol/L Na2C03 边加边摇，直至呈现浓厚之絮状物为向管慢慢加 O.1mol/L HAc 直至出现浓厚之絮状为止将两管分别于酒精灯上煮沸，注意有无凝固现象。冷却后再分别向管滴加 0.1mol/L HC

3、1 2 滴，管滴加 0.1 mol/L NaOH 2 滴，是否仍能溶解 ? 为什么 ?二、蛋白质沉淀反应蛋白质由于水化层和电荷的存在，因此其水溶液具有亲水胶体的性质。 凡能破坏蛋白质水化层和电荷存在的因素，均可使蛋白质从溶液中沉淀出 来，这种蛋白质由溶液中析出的现象称为蛋白质的沉淀反应。大多数蛋白质经盐析反应或在低温下用乙醇或丙酮短时间作用使蛋白 质沉淀后，除去上述因素，蛋白质又能溶于原来的溶液中，属于可逆的沉淀 反应。但用重金属盐类、生物碱试剂、加酸及加热引起的蛋白质沉淀反应， 一般均属于不可逆沉淀反应。( 一 ) 蛋白质的盐析1.原理蛋白质属亲水胶体，向蛋白质溶液中加入一定浓度的各种中性盐

4、类，既 能除去蛋白质颗粒的电荷，又能除去其水化层，因此蛋白质容易从溶液中沉 淀下来。由于大量盐类存在而使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法叫做盐析。 不同蛋白质盐析时所需盐的浓度各异， 因而可以用不同浓度盐溶液分离不同 的蛋白质，这种方法称为分段盐析。常用作盐析的中性盐有： (NH4)2S04、Na2S04、Na3P04、NaCl、MgS04 等。几乎所有的蛋白质都可用饱和硫酸铵溶液盐析出来， 而某些蛋白质 (如球 蛋白)在半饱和 (NH4)2S04 中析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，经透析或水稀释降低盐浓度时，沉淀又能溶 解，故蛋白质的盐析是可逆过程，常用于提纯各种蛋白质及酶类。2. 操作(1) 向

5、试管内加入蛋白质溶液 2ml 及等量的饱和 (NH4)2S04 液混匀，即 为半饱和硫酸铵，静置 3 min 后，观察及解释所见现象。（2） 将上述试管内容物过滤。把滤液分为两份，于一份中加入结晶硫酸 铵粉末 （约 0.3g），直到最后粉末不再溶解为止，则呈饱和硫酸铵溶液。另一 份滤液作为对照，比较两份滤液有何不同？试解释之。（ 二 ） 重金属盐沉淀蛋白质1.原理在等电点碱侧，蛋白质呈负离子，能与重金属离子 （如铜、银、汞等 ）结 合成不溶性蛋白盐而沉淀。2.操作取试管 1支，加蛋白液 1ml，0.1mol/L NaOH 2 滴，混匀，滴加CuS04 溶 液，随加随摇匀至出现沉淀为止。（ 三

6、） 生物碱试剂沉淀蛋白质1.原理蛋白质在等电点的酸侧，带有正电荷，能受生物碱试剂的作用而沉淀。常用作沉淀蛋白质的生物碱试剂有：苦味酸、三氯醋酸、钨酸、磷钨酸、鞣 酸等。生物碱试剂对蛋白质的沉淀常较完全，故常用来制备无蛋白滤液。2. 操作取试管 1支加入蛋白液 1ml，滴加饱和苦味酸 6 滴，观察并解释。三、注意事项1. 酒精灯加热试管时，用木夹夹在试管上 1/3 处，试管倾斜 45 ，管 口朝无人方向，严防液体喷出伤人。3. 用过滤纸集中放于污桶，切务乱丢弃。4. 苦味酸属危险试剂 （有毒，有爆炸性 ），配制时，用水浴加热促溶，用过的容器先用大量清水冲洗，然后再行清洁处理四、材料和试剂（一）

7、主要材料酒精灯，中试管，木试管夹，各种规格点滴瓶 （ 管），滤纸，漏斗等。（二）主要试剂鲜鸡蛋， HCl ，NaOH，冰 HAc，NaAc，硫酸铵， CuS04，苦味酸等。（三） 配制110% 蛋白液取新鲜鸡蛋清 30ml（约 2个鸡蛋），用蒸馏水配制，注意充分搅拌，最后 定容到 300 ml，用少量脱脂棉过滤。滤液放 4备用，可保存一周。2pH4.8NaAc - HAc 缓冲液0.2mol/lNaAc 5.90ml ，0.2mol/l HAc 4.10ml 混匀。3饱和硫酸铵溶液 1000ml称固体（NH4）2S04 850g 加入 1000ml蒸馏水中，在 70-80下搅拌促溶， 室温中放置过夜，瓶底析出白色