冷冻电镜简介0001

1、冷冻电镜简介1冷冻电镜发展背景1=因组学，并在原子水平上解释核酸一蛋白，蛋白 蛋白之间的相互作用，从而阐明由这些生物大 分子和复合物所行使的生物学功能。在此过程 中，结构生物学在其中扮演着重要角色。对生物 大分子结构的解析，不仅具有深远的基础意义， 而且具有广阔的应用前景。通过对核酸、蛋白质 及其复合物的结构解析，人们对它们的功能的理 解更加透彻，就可以根据他们发挥功能的结构基 础有针对性地进行药物设计，基因改造，疫苗研 制开发，甚至人工构建蛋白质等工作，从而对制人类基因组计划的完成，标志着科学已进入后 基因组时代。虽然大量的基因序列得到阐明，但 是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、

2、折叠、组装，形成有功能的结构单元，尚需进一 步的研究。后基因组时代人类面临的一个挑战是 解析基因产物一蛋白质的空间结构，建立结构基药、医疗、疾病防治、生物化工等诸多方面产生 巨大的推动作用。常常是分子的基态结钩，而对解析分子的激发态 和过渡态却往往无能为力：生物大分子在体内常 常发生相互作用并形成复合物而发挥功能，这些 复合物的结晶化非常困难。核磁共振波谱学虽可日前用于解析生物大分子空间结构的主要手 段是X射线晶体学技术和核滋共振波谱学。X 射线晶体学可给出分子的高分辨结钩，核磁共振 波谱学则可测定分子在溶液中的精确构像，并可 研究构像的动态变化。虽然X射线晶体学和核 磁共振波谱学是解析生物大

3、分子结构的强有力 工具，但各有局限性。X射线晶体学解析的结构=1获得分子在溶液中的结构并可研究结构的动态 变化，但目前只能用于分子量较小的生物大分子 （1000011尔顿），市尬务子量夫的生勃大劳字 尤其是超分子复合物却无能为力。人类对生物体系的研究经历了由个体到器官， 由器官到组织，由组织到细胞，由细胞到生物大 分子这样一个层次由高到低的过程。随着科学的 发展，人们对生物体系的研究又转向由低层次到 高层次，由简单体系到复杂体系。在此过程中， 细胞作为生命的基本单位起着承上启下的重要 作用。多少年来，科学家的一个梦想是能观察到 生物大分子在细胞内的行为，几十年来，人们对 大量的生物大分子及其复

4、合物应用电子显微镜 进行研究，发展出了强有力的电子显微学来研究 生物大分子结构的方法学。近年来，由于快速冷 冻和低温冷却技术的引进，导致了冷冻电子显微 学技术的诞生。冷冻电镜在研究生物大分子结构 尤其是超分子体系的结构方面取得了突飞猛进 的发展，在生物学领域的应用越来越受到重视， 逐渐成为一种被普遍接受的公认的研究生物大 分子尤其是超分子体系结构的有效研究手段，成 为连接生物大分子和细胞的纽带和桥梁。2冷冻电镜发展过程及分类2.1冷冻电镜发展过程microscopy）是在20世纪70年代提出的，早在冷冻电子显微镜技术（cryo-electron 20世纪70年代科学家们就利用冷冻电镜研究病 毒

5、分子的结构，首次提出了冷冻电镜技术的原 理、方法以及流程的概念。到了 20世纪90年代, 随着冷冻传输装置、场发射电子枪以及CDD成 像装置的出现，冷冻电镜单颗粒技术出现。21 世纪初，冷冻电镜技术进一步发展，利用三维重 构技术获得了二十面体病毒的三维结构，但此时 冷冻电镜的分辨率水平依然没有得到突破，这限 制了冷冻电镜在生物大分子领域的应用，虽然冷冻电镜和X射线晶体学、核磁共振被称作结 构生物学研究的三大利器，但不得不承认冷冻电 镜是三者当中最弱的一种技术手段， 在现在已解 析的一千多种膜蛋白结构当中，90%以上都采用 的是X射线晶体学方法，核磁共振在小分子量 的蛋白结构解析中也发挥了重要的

6、作用，而冷冻电镜在蛋白结构解析当中所起的作用微乎其微。然而2013年12月5日，美国加州大学旧金山 分校副教授程亦凡与同事 David Julius两个实验 室合作，采用单电子计数探测器，以近原子分辨 率（3.4埃），确定了在疼痛和热知觉中起中心作 用的一种膜蛋白TRPV1的结构，这一振奋人心 的成果让研究人员们开始重新审视冷冻电镜在 结构生物学研究中的所能发挥的作用。 毕竟和X 射线晶体学方法相比，它所需的样品量很少，也 无需生成晶体，这对于一些难结晶的蛋白质的研 究带来了新的希望。蛋白质 TRPV1结构的确定 标志着冷冻电镜正式跨入“原子分辨率”时代。2.2冷冻电镜分类目前我们讨论的冷冻电

7、镜基本上指的都是冷 冻透射电子显微镜，但是如果我们以使用冷冻技 术的角度定义冷冻电镜的话，冷冻电镜主要可以 分为冷冻透射电子显微镜、冷冻扫描电子显微 镜、冷冻蚀刻电子显微镜。2.2.1冷冻透射电子显微镜冷冻透射电镜（Cryo-TEM）通常是在普通透 射电镜上加装样品冷冻设备，将样品冷却到液氮 温度（77K），用于观测蛋白、生物切片等对温 度敏感的样品。通过对样品的冷冻，可以降低电 子束对样品的损伤，减小样品的形变，从而得到 更加真实的样品形貌。一台冷冻透射电镜的价格在 600万美元左右，价格极其昂贵，它的优点主要体现在以下几个方 面：第一是加速电压高，电子能穿透厚样品；第 二是透镜多，光学性能

8、好；第三是样品台稳定； 第四是全自动，自动换液氮，自动换样品，自动 维持清洁。图2.1冷冻透射电镜及冷冻电镜下高分辨病毒的三维重构图2.2.2冷冻扫描电子显微镜扫描电镜工作者都面临着一个不能回避的事 实，就是所有生命科学以及许多材料科学的样品 都含有液体成分。很多动植物组织的含水量达到 98%，这是扫描电镜工作者最难对付的样品问 题。冷冻扫描电镜(Cryo-SEM )技术是克服样品 含水问题的一个快速、可靠和有效的方法。这种 技术还被广泛地用于观察一些“困难”样品，如那些对电子束敏感的具有不稳定性的样品。各种高压模式如 VP、LV和ESEM的出现，已允许 扫描电镜观察未经冷冻和干燥的样品。但是

9、，冷冻扫描电镜仍然是防止样品丢失水分的最有效 方法，它能应用于任何真空状态，包括装于SEM 的Peltier台以及向样品室内冲以水汽的装置。 冷冻扫描电镜还有一些其他优点，如具有冷冻断 裂的能力以及可以通过控制样品升华刻蚀来选 择性地去除表面水分(冰)等。冷冻电镜基本的 观测流程如下图2.2所示：高宦冷拣 G 冷冻断裂/喷涂 Q 真空冷冻传输=Cryo SEMSka EM HPhrtIdea EM SCD5OOLeica EM VCT100Gyt)軸涎 in 共MH划h Pressure Freeling High Vc Sputter Cbdter Vacuum Cryo Transfer图

10、2.2低温扫描电镜样品制备及观测流程2.2.3冷冻蚀刻电子显微镜冷冻蚀刻(Freeze-etching电镜技术是从 50年代开始发展起来的一种将断裂和复型相结 合的制备透身*电镜样品技术，亦称冷冻断裂(Freeze-fracture)或冷冻复型(Freeze-replica)， 用于细胞生物学等领域的显微结构研究。冷冻蚀刻电镜的优点：样品通过冷冻，可 使其微细结构接近于活体状态；样品经冷冻断 裂蚀刻后，能够观察到不同劈裂面的微细结构， 进而可研究细胞内的膜性结构及内含物结构；冷冻蚀刻的样品，经铂、碳喷镀而制备的复型膜， 具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期 保存。缺点：冷冻也可造成样品的人

11、为损伤； 断裂 面多产生在样品结构最脆弱的部位，无法有目的 地选择。目前，冷冻蚀刻装置的型号很多，但主要分 为两种类型：一种是专用冷冻蚀刻装置，如 EIKO 公司生产的FD-2A型、FD-3型， BALZERS公司生产的BAF300型；另一种是真 空喷镀仪的冷冻蚀刻附件，如日立公司生产的 HFZ-1型，它与FE-1型加温蚀刻装置一起安装 在HUS-5型真空喷镀仪中使用。以上两种类型 各有优缺点，专用装置优点在于操作方便，能连 续制样，效率高。缺点是价格贵；附件装置价格 虽便宜，但不能连续操作，效率低。利用冷冻蚀 刻电镜技术观察到的红细胞如图 2.3所示。图2.3红细胞冷冻电镜蚀刻图3冷冻电镜原

12、理冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结 构的核心是透射电子显微镜成像，其基本过程包 括样品制备、透射电子显微镜成像、图像处理及 结构解析等几个基本步骤（图3.1）。在透射电子 显微镜成像中，电子枪产生的电子在高压电场中 被加速至亚光速并在高真空的显微镜内部运动， 根据高速运动的电子在磁场中发生偏转的原理， 透射电子显微镜中的一系列电磁透镜对电子进 行汇聚，并对穿透样品过程中与样品发生相互作 用的电子进行聚焦成像以及放大，最后在记录介 质上形成样品放大几千倍至几十万倍的图像， 利 用计算机对这些放大的图像进行处理分析即可获得样品的精细结构图3.1冷冻电子显微学解析结构基本步骤Electrau S

13、ourceeere-Samplec embedded lh vitreous ice2 D Image图3.2冷冻电子显微学原理示意图透射电子显微镜成像过程中，电子束穿透样 品，将样品的三维电势密度分布函数沿着电子束 的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平面 上。1968年，Aron Klug发现中心截面定理（图 3.3），提出可以通过三维物体不同角度的二维投 影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的 三维结构。根据这一原理，利用透射电子显微镜 获得生物样品多个角度的放大电子显微图像，即有可能在计算机里重构出它的三维空间结构。实空间傅里叶空间图3.3中心截面定理在冷冻电子显微学结构解析的具体实

14、践中， 依据不同生物样品的性质及特点，可以采取不同 的显微镜成像及三维重构方法。目前主要使用的 几种冷冻电子显微学结构解析方法包括： 电子晶 体学、单颗粒重构技术、电子断层扫描重构技术 等，它们分别针对不同的生物大分子复合体及亚 细胞结构进行解析。3.1电子晶体学利用电子显微镜对生物大分子在一维、 二维 以致三维空间形成的高度有序重复排列的结构 （晶体）成像或者收集衍射图样，进而解析这些 生物大分子的结构，这种方法称为电子晶体学。 其适合的样品分子量范围为 10500kD，最高分 辨率约1.9?。该方法与X射线晶体学的类似之 处在于均需获得高度均一的生物大分子的周期 性排列，不同之处是利用电子显微镜除了可以获 得晶体的电子衍射外还可以通过获得晶体的图 像来进行结构解析。3.2单颗粒技术对分散分布的生物大分子分别成像，基于分 子结构同一性的假设，对多个图像进行统计分 析，并通过对正、加和平均等图像操作手段提高 信噪比，进一步确认二维图像之间的空间投影关 系后经过三维重构获得生物大分子的三维结构 方法（图3.4）。其适合的样品分子量范围为 8050My 最高分辨率约3?。利用单颗粒技术 获得三维重构的方法主要包括等价线方法、随机 圆锥重构法、随机初始模型迭代收敛重构等方 法，其基本目