荧光光谱的原理及应用.

1、2冯蕊福州大学测试中心荧光光谱仪的原理、操作及数据处理荧光光谱的基本原理荧光定义荧光是磁飪迂的一种，是物质从裁发惑 失活到运住相同的低能状态时所释放的 辐射。4基态和激发态当一个分子中的所有电子的排布都遵从磁極7时，此分子被称为处于基态。激发态：当一个分子中的电子排布不完全遵从赦适瀕理 时，此分子被称为处于激发态。构造原理：电子在原子或分子中排布所遵循的规则。能量最低原理”泡利不相容原理-洪特规则5电子激发态的多重度M = 2S+1s为电子自旋量子数的代数和（0或1）；基态U号态峨发单审态厭发三审态T根据洪特规则（平行自旋比成对自旋稳定）.三重态能级比相应单重态能级 任；大多数有机分子的基态处

2、于单更态;分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级;激发：基态JSjf激发态IS、Q激发态振动能级）：吸收 特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；失活： 激发态f基态:多种途径和方式（见能级图）；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势;第一、第二、电子激发单重态S、Q； 第一、第二、电子激发三靈态T、T2 ；内转换雅布隆斯基分子能级图能&卜转发射磷振动她像9跃迁规则Franck-Condon 原理：在电子跃迁完成的瞬间，分子中據宁细能型是来不及改 变的。跃迁前后似尹疣轴迦有发生改变、跃迁过程中电子口旋&為 改变、跃迁前后购子的轨道桎空间有较大的重樟和轨道的对映

3、性 发生了改变的跃迁是允许的；跃迁过程中电子自磁生了改变、跃迁前后电子的轨道在空间不 重叠或轨道的对映性升发生改变的跃迁是禁阻的.11失活的途径子处于激发态是不稳定状态.容易返回基态，在这个过程中通过 磁獗迂（发光）和龙蘊豹溉迂等方式失去能最,这个过程就称为失活.失活途径辐射跃迁I系间窜越内转换外转换振动弛係液鬆停留时间短.返回速度腆途毀.发生的几率大.无辐射跃迁失活的途径动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振 动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时 间一般为10nSo内转换：多重度相同的电子能级中等能级间的无辐射能级跃迁。通过内转换和振动弛豫,高激发单重态的电子跃回第一 激发

4、单重态的最低振动能级。1311外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转 移能量的非辐射跃迁；外转换或磷光嗣或猝灭”。系间窜越：不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子口旋,禁阻跃迁,通过口4 轨道耦合进行。辐射跃迁失活的途径荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级f基态（多为 S f 跃迁），发射波长为2的荧光；10-710T S .由图可见.发射荧光的能量比分子吸收的能量小P波长长; 2 2 久 2 久 I ；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（多为 珀f 4跃迁）；发射波长为 弘的磷光；10-4100 s 电子由 氏进入7；的可能过程：（7；禁阻跃

5、迁） 氏一激发一振动弛豫f内转换系间窜越振动弛豫一7； 发光速度很慢,光照停止后可持续一段时间.13主要光谱参量化合物的吸收光强与入射光波长的关系曲线O激发谱闻定纽滋长（一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位），扫描 出的化合物的总购细荧光/磷光）与入銚级长的关系曲线。发射谱圖融发玆长（一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位）,扫描出 的化合物的羞的宠资荧光/磷光）与人册淤长的关系曲线。15主要光谱参量磁进反映出的足物质的基态能级与激发态能级Z间所有的允许跃迁。 通常状态下的物质的葩泌大部分时候取决于其磁證住.滋发诸则反映的是基态与所有与该荧光发射有关的能级之间的跃迁.其所 呈现的关系比吸收谱要有

6、选择性.但有时候又不如吸收谱来的宜接.电子跃迁到不同激发态能级 时，吸收不同波长的能量（如 能级图人，人），产生不同吸 收带，但均回到第一激发单 重态的最低振动能级再跃迁 回到基态，产生波长一定的 荧光（如秽2 ）因此，题15f斯托克位移-个化合物的发射光谱常常与其吸收光谱很类似，但总是较相应的吸收光谱红移，送称为斯托克位移（Stokeshifts .16蔥在溶液中的吸收（虚线） 和发射（实线）光诅斯托克位移产生斯托克位移的主要原因:1跃迁到激发态高振动能级的激发态分子，首先以更快的速 率发生振动弛豫（其速率在10】3/s数量级），散失部分能量， 达到零振动能级，一般从零振动能级发射荧光；2激

7、发态形成后，其分子的构型将很快进一步调播，以达到 激发态的稳定构型，这又损失了部分能就；”3.发射荧光的激发态多为（7T, 7T*）态，这种激发态较基态 时有更大的极性，因此将在更大程度上为极性溶剂所稳定，使 激发态的能量进一步降低。17反斯托克位移不过，有时在高温下也可观察到磁狂啟痉现象，即荧光光谱移向 吸收光谱的短波方向。这是由于髙温使更多的激发态分子处于高振动 能级，荧光主要从激发态的高振动能级发出所致既没发生斯托克位移也没发生反斯托克位移的荧光称去磁龙。18镜像规则荧光发射是光吸收的逆过程。荧光发射光谱与吸收光谱有类似镜影 的关系。但当激发态的构型与基态的构型相差很大时，荧光发射光 谱

8、将明显不同于该化合物的吸收光谱。A/nm250330400500蕙的乙醇溶液的荧光光谓（右）和眠收光谱（左）图19荧光光谱与磷光光谱荼的澈发光W（I）.荧光 （II）和确光（111）光谱图荧光光谱固定澈发光波长物质发射的荧光强度与发 射光波长关系曲线，如右图中曲线口。荧光本身则是由电子在两能级间不发生自 旋反转的辐射跃迁过程中所产生的光。磷光光谱固定激发光波长物质发射的磷光强度与 发射光波长关系曲线，如右图中曲线 磷光本身则是由电子在炳能级间发生自旋 反转的辐射跃迁过程中所产生的光.光谱图21内滤光作用和自吸收现象内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧 光，如色胺酸中的重钻酸钾；

9、自吸收现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如恿化合物。23荧光寿命荧光寿命 是荧光强度衰减为初始时的1/e所需要的时间, 常用I表示。如荧光强度的衰减符合指数衰减的规律：T T p-kt 丄t 一丄0。其中I。是激发时最大荧光强度，g是时间t时的荧光强度，k是衰滅常 数。假定在时间i时测得的匚为I。的1/e，则i是我们定义的炎龙厠。23inaxShort pulse寿命T是衰减常数k的倒数。事实上.在瞬间激发后的某个时间，荧光强度 达到最大值，然后荧光强度将按指数规律下降。从最大荧光强度值后任一 强度值下降到其1/e所需的时间都应等于“24如果激发态分子

10、只以发射荧光的方式丢失能量，则荧光寿命与荧光发射速率的衰减常数成反比。因此有= 1/Kps叢示荧光分子的固有荧光寿命,&浪示荧光发射速率的衰减常数。莢吻泼射速華即为单位时间中发射的光子数。25荧光寿命处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一 些其它过程（如淬灭和能最转移）回到基态，其结果是加快了激发态 分子回到基态的过程（或称失活过程），结果是荧光寿命降低菱塾和这些过程的速率常数有关，总的失活过程的速率常数k可以 用各种失活过程的速率常数之和来表示：k=kF+Ski&表示各种非辐射过程的衰减速率常数。则总的寿於Z为：t =l/k=l/ (kp+kj)荧光寿命由于吸收几率与发射

11、几率有关，T占最大吸收位置的摩尔消光系数 x （单位为cmmol.或（mol-dm 3） cm *）也密切相关。从下式可以得到的粗略估计值（单位为秒几1/工严104 8max注意：在讨论寿命时，不要把寿命与尿迁时闻混淆起来跃迁时间是跃迁 频率的倒数，而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。27延迟荧光通过测量寿命，可以得到有关分子结构和动力学方面的信息。一般荧光寿命为10-8s,最长可达10-6so但有时却可能 观察到长达10一。这种长寿命的延时发射的荧光，被称为産舷龙或缓发荧光。延迟荧光与普通荧光的区别主要在于磁麦虚还甸.这种长寿命 的延迟荧光来源于从第一激发三重态（TJ直新生成的S1态的

12、辐射跃 迁。即延迟荧光产生的过程为：SjT1SjS（）+hvf28延迟荧光当第一激发单重态Si与第一激发三重态T|能差较小时，T】态有时可从 环境获取一定的热能后又达到能量更高的Si态。即TiSi这种现象首先从四澳荧光素(eosin)观察到，故碍名E型延迟荧光。P型延迟荧光：当单重态(SJ与三重态(TJ能差较大时，Ti不可能靠从环境取 得热能而到达S】态。这时有可能在两个三重态分子靠近时，通过两 个三畫态分子的湮灭过程畫新生成S】态.即S j+S| T1 1 T1) S(|+S | So+Sy+hVp这种现象首-先从花(pyrene)和菲(phenanthrence)观察到，故得名3129荧光

13、童齐产爭是物质荧光特性中最基本的参数之一，它表示物质发射荧光的效率。荧光虽子产率通常用4来表示，定义为荧光发射量子数与被物质吸收的光子数公J也可表云为荧光发射强度与被吸收的光强N比.或表云为荧光发射速率乌吸收光速率常数N比 RP：4 =荧光发射量子数/吸收的光子数=kjSj/吸光速率=If/Ia量子产率一般情况下，荧光量子产率（）不随激发光波长而改变，这被称为 Kasha VavilovfllJ.但如果形成的激发态会导致化学反应或系间窜越 与内转换的竞争，则可能使e受到影响。例如，在低压气相以254 nm 的光激发苯，4 = 0.4,而当以小于240 nm的光激发苯时，则未检测 到荧光.这是由

14、于苯的高振动能级的S,态会使其转变为杜瓦苯.不同 化合物的差别可以很大31另外，e还会受环境（如温度、溶剂尊）的影响，例如，降低温度 可导致一个化合物的e增大，提高温度可导致一个化合物的e降低。由于荧光的非单色性、各向的不均匀性和二级发射等原因，荧光量 子产率的直接测定的重复性往往较差。因此，实际测量中大多采用的 是相对法,即用一已知其荧光量子产率的参比化合物在相同条件下对 照测定，并可通过公式计算目标化合物的荧光量子产率：4 = sIesc/（Isc）九、C.和.分别足參照物的荧光量子产率（已知）.摩尔消光系数、溶 液浓度和荧光强度；0、C和I分别是被测物的荧光量子产率（未知）、赚 尔消光系

15、数.溶液浓度和荧光强度畚照物应是d已知.无自吸收、无浓度猝灭.在被測物所用溶剂中可溶、盪 磁、盛和竝逐越fi?的物质。常用的参照物如罗丹明B和睫咻硫酸氢盐 等。33荧光产生的条件化合物能够产生荧光的必要条件是:它吸收光子发生多重性不变的跃迁时所吸收的能最小于断裂其最弱的化学键所需要的能量。另外，化合物要能发生荧光，其结构中必须有叙基团。 荧光基团都是才疗不翻7超的基团，当这些基团是分子的 共轨体系的一部分时，则该化合物可能产生荧光。33影响荧光的主要因素1荧光助色团与荧光消色团:可便化合物荧光増强的基团被称为荧光助色团。一般为给电子取代基、如-冊2、-0H等。相反，吸电子基团 如-COOH、-

16、CN等将减弱或抑制荧光的产生，被称为突34影响荧光的主要因素增加稠合环可增强荧光:增加共平面的稠合环的数目，特别是当稠合环以线型排列时，将 有利于体系内兀电子的流动，从而使体系发生跃迁所需吸收的能绘 降低，进而有利于荧光的产生。3.提高分子的刚性可增强荧光：刚性增强后，将减弱分子的振动，从而使分子的激发能不易因振 动而以热能形式释放；另外，分子刚性的增加常有利于增加分子 的共平面，从而有利于増大分子内兀电子的流动性，也就有利于荧 光的产生.35影响荧光的主要因素激发态电子组态的影响：根据电子跃迁规则，S|态的电子组态是（兀，分）态时，有利于荧 光的产生，当S态的电子组态是（n, x*）态时，不

17、利于荧光的产 生.5.重原子将导致荧光量子产率的降低：重原子具有增强系间审越的作用，将増大从S态向T|态的系间审越的速率常数和量子产率，从而导致降低荧光量子产率。36彩响荧光的主要因素溶剂极性的影响:增加溶剂的极性，一般有利于荧光的产生。7.5l度的影响:降低体系温度可以提高荧光量子产率。&其它影响因素如氢键.吸附.溶剂粘度增加等均可提高荧光的量子产率.这都 可用减少了分子的热振动和增加了分子的刚性来解释。373.C.H,CH270 310270- 3201017M墓*27” 32017M代*C.H,F270- 32010W代QHC1275- 3457演代*3 SO5離代CJHJ0C.HQH2

18、5 36518酚离子CH.0-3】0 40010萃甲C.H,OCH.285- 34520胺310 40520苯胺离子C 已 NHf0琴甲C3,COOH310 3如3苹矗c6h5cn20 36020039荧光光谱仪的原理、操作及数据处理39荧光光谱仪的基本原理41在实验样品受到激发的 情况下，通过选择合适 的探测器和工作模式， 记录下发射光强与激发 源特性、样品特性以及 温度、时间、空间、能 量等相关特性之间的关 系，以此来更好的研究 或利用发光过程.样品准备块状体1. 为了获取尽可能理想的光谱，减小内外表面因素的干扰，最好切2. 如果要做系列样品特性的对比，应尽還:在尺寸和光洁度上将其制为4.

19、 对于与各项异性有关的测试，务必要注意龙沁込上5. 对于有舷农特性的样品要注意其对测试结果的影响。41样品准备粉体和微晶1. 避免混入诸如滤纸纤维、胶水等杂质,以免其发光对测试结果产生 影响。2. 样品应尽量保存在不会刃人杀赦紡沁比的样品管（盒）中.3. 对于强光下不稳定的化合物，测试时应特别注意血仏她血磁, 避免破坏样品。4. 粉体和微晶样品一般夹在适速趣屋进行测试。42样品准备液体1. 溶液样品尽最便用透明的玻璃化溶液避免在这种汇聚式光路中由于比色皿中溶液的前后吸收不均导致的光谱失真问题。2. 为安全起见，对于使用挥茨性超翩茄的测试，一定要有合适的 防护.3. 易挥发、易变质的溶液最好现配

20、现测。434. 液体样品一般放在带盖石英比色皿（与紫外测试所用比色皿不同, 为侧面全透明型）中进行测试。由于物质的发射特性和吸收特性是紧密相关的.所以提前做 好吸收谱可以有效缩短荧光测试的摸索时间。对于不知道相关特性的样品，吸收谱的测试比荧光光谱的测 试要容易很多。所以，蠱议卞：彖先测一下样品的吸收谱,并从中找出感兴趣的吸收峰和特性、在荧光测试时以便参考。44光谱测试1 开机电源灯源2.发射谱根据吸收谱中感兴趣的峰确定激发波长，选择合适的发射谱波长 范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行发射谱的扫描。3 激发谱Hi1=47根据发射谱中感兴趣的峰确定发射波长，选择合适的激发谱波长 范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行