FACSDiva操作说明资料讲解

1、精品文档FACSDiva 操作说明书首先熟悉一下 Diva 的操作界面1Browser通过点击菜单栏的相应的按钮，可以隐藏或展开相应的模块2通过 Browser ，可以对数据库进行管理，Browser 列出了文件夹、实验、及实验所包含的样本和管子。精品文档精品文档Acquisition control 对获取和记录数据进行操作Instrument 仪器设置这个框显仪器框显示了仪器连接状态， 当打开一个实验， 试管指向定位于一个试管时， 示的是当前试管的仪器设置。5 浏览框浏览框显示了 worksheet 或者 Browser 中选中的部件的属性，可进行修改。worksheet精品文档精品文档W

2、orksheet 框，可进行画图、设门、设逻辑关系，进行统计等。7获取状态显示了获取或记录数据时的状态。必须先新在基本熟悉 Diva 的界面后，下面就进行一个实验。 在 Diva 软件上进行操作， 建一个实验（实验必须建立在文件夹中） 。下面描述的是如何使用这些命令：Creating a Folder and an Experiment 这部分描述了如何创建一个 Practice 文件夹和包含有基础分析的实验。1、在浏览框的菜单栏中单击 2、重命名为 Practice，如下图3、选择 Practice 文件夹，点击浏览框菜单栏的在文件夹下就创建了一个新的实验，这个实验包含了默认的仪器设置和一个

3、空白的global worksheet 。4、点及增加Specimen 快捷键可加一个样本和试管。精品文档精品文档5、浏览框中点击左边的样本指向，指向tube-001。样本指向变成绿色，说明当前 Expriment 和 Acquizition control 中显示该 tube 的属性。6、在 Browser 中选择每一项，看看 Inspector 框的变化。当 tube-001 被选择时，在 Inspector 中可以看到有四个标签，分别点击看看变化。 在这版软件中，一些仪器设置不能在 Inspector 中修改。当与流式细胞仪相连接时，可 以在 Instrument 框中改变电压、域值和补

4、偿。7、选择 Expriment Expriment Layout ，对每个参数进行定义，如下图。 当你的实验包含有很多试管时，你可以用 Expriment Layout 来一次标记所有试管。8、在 Expriment Layout 对话框中，点击 Acquisition 标签，选择 Tube-001 ，改变计数粒子为 10000，点击 OK 。当你在浏览框中选择 Tube 001 时，在 Inspector 中的 Labels 和 Acqui 中的选项也随着改变。9、在 Global worksheet 中创建一个FSC vs SSC 点图在 worksheet 菜单栏中点击，再在 work

5、sheet 中点击一下， 就创建了一个默认大小点图。10、在 FSC vs SSC 点图中边上创建一个 PE 直方图在 worksheet 菜单栏中点击直方图工具，再点击 worksheet ，一个默认大小的直方图 就建立好了。精品文档精品文档点击 X 轴标签，在下拉菜单中选择 PE-A ，可改变图的参数。注意参数的名字是你先前 设定的参数名。11 在 FSC vs SSC点图下面创建一个 FITC vs PerCP-Cy5.5 的点图 按住 Ctrl 键，点击 FSC vs SSC 图的边缘，往下拖。当你拖的时候，就创建了一个复制 的点图。把点图放在合适的位置，松开鼠标，这个方法可以复制任何

6、的点图。点击坐标轴， 选择合适的参数。12创建一个 Population Hierarchy Population Hierarchy 是用来列出定义的亚群。右击任何点图，选择 Show PopulationHierarchy ，把结果图拖到 FITC vs PerCP-Cy5.5 点图的右侧。 Worksheet应该看起来类似于下图：Exporting an Experiment as a Template 现在已经创建好一个实验了，可以导出成为一个模板。实验模板包括了样本、试管、关 键词、仪器设置、标签、 worksheet 上的图以及 worksheets（包括所有设置，如分页） ，但不

7、 包含有数据。 一个实验可以保存为一个模板，为了简化浏览框，模板不通过浏览框选择。1、在浏览框中选择 Expriment-001 ，再选择 File Export Expriment Template 。 确定选择的是 Expriment Template 命令，而不是 Expriment 命令。Export Experiment Template Wizard 出现，对话框上的黑体字告诉你每个框的作用2在模板类型中输入 Practice，模板名字中输入 Simple Analysis 。 模板类型用来对类似的模板进行分组， 以便于查找。 当你在创建一个模板时， 至少要输 入类型和名字，后面的

8、选项是可选项。精品文档精品文档3点击 Next ，可查看后面的选项，点击 Finish 。Creating an Experiment from a Template 现在可以用原来保存的模板来创建一个实验。 记住当你想在一个文件夹中创建一个实验 时，首先要选择文件夹。1、选择 Practice文件夹，选择 Experiment New Experiment 。 当你想用原来保存的 Exprement 模板时，使用菜单栏而不是快捷键，你也可以按Ctrl-E 。Experiment Templates 对话框出现2、在对话框中，点击Practice 标签，选择 Simple Analysis t

9、emplate ，点击键。ExperimentLayout 对话框出现，显示试管标记、关键词、模板的设置等。3点击 Experiment Layout 对话框中的各种标签，查看设置，然后点击Cancle。这些设置是你建立模板时设定的，注意：这些数据是只读的，不能修改。4点击 OK建立一个新的实验 注意原先的实验已经关闭， 一个新的实验 Simple Analysis 在浏览框中。 当你在做实验时， 一次只能打开一个实验。注意global worksheet中包含有点图和 Population Hierarchy ，在点图中没有数据。Importing an Experiment 接下来，你将在

10、 Practice文件夹中导入一个实验。导入实验与导入模板的不同之处在于 它们包含有记录的数据。精品文档精品文档1、选择 Practice文件夹，选择 File Import Expriments 默认情况下， 当导入一个实验时， D:BDExportExperiment folder 将会出现， 除非你以前 改变路径导向到另一个文件夹。2、选择命名为 Manual Comp的文件夹，点击 Import 。Expriment导入的实验都是以文件夹形式出现，文件夹在导入后在浏览框中将会以实验 出现。注意原先的实验没有关闭，新的实验加在Simple Analysis Experiment 后面有三

11、种方法在浏览框中增加实验：1、用浏览框工具栏中的快捷键来新建一个空的实验(默认条件设置) 。2、Expriment New Expriment 命令新建一个新的实验，实验来自于一个原来保存的模板， 模版包含下列部分：点图、门、统计图和仪器设置。3、File import Expriment 命令，可新建一个实验，通过这个方法获得的实验包括原来保 存的实验条件等和数据。Working with Experiments in the Browser 现在在浏览框中有三个实验，一个关闭的实验 (Experiment_001), 一个打开的实验模板(Simple Analysis) 和一个关闭的导入的

12、实验 (Manual Comp) 。 接下来的练习来证明关闭和打开的实验之间的不同，以及如何来比较仪器设置。1、点击 Manual Comp Experiment 前面的( + )，展开实验。尽管在 browser 框中显示出实验组分，但点图依旧是空白的，你必须打开一个实验来获 得它的数据。注意：展开一个实验和双击打开一个实验是不同的精品文档精品文档2、双击 Manual Comp Experiment 来打开Simple Analysis Experiment 关闭， 在worksheet中显示 Manual Comp Experiment 中的分析目标。3、点击其中一个实验样本Manual

13、 Comp Experiment 中，在每个样本下面含有多个试管， 注意每个试管都是绿色的， 说明每个试管都包含有数据。4、点击试管指示到任何一个试管。在global worksheet 中包含有点图、 试管中含有数据， 数据就显示在 worksheet中，可用试 管指示来定位试管，则将显示所选择试管的数据。5、在 browser 中选择其它试管注意：数据并没有改变， 必须依靠试管指示， 才能在 global worksheet 中显示其他试管的数据。 尝试把试管指示指向另一个试管，注意数据的变化。6、展开 Simple Analysis Experiment ，选择 Instr Settin

14、gs 。注意 Inspector上的仪器设置是所选 Instru settings 的设置，尽管实验已经关闭。7点击 Instrumengt 框中的各个参数Instrment 框显示了试管指示所对应的试管的仪器设置(Manual Comp Experiment 中的tube)。Inspector显示的是试管的设置或者是所选择的 Instr Settings 的设置。在这个例子里， Inspector 显示的是 Simple Analysis Experiment 实验的仪器设置，你可以用 Instrument框和 Inspector来比 较浏览器中的任何两个仪器设置。精品文档精品文档显示的是M

15、anualComp_001 中 PE 试管 的仪器设置显示的是simpleAnalysis_001 的Settings 的仪器设置instruUsing Gating Features在BD FACSDiva 软件中：可以创建四种类型的门： polygon 、rectangle、quadrant和 interval 。 自动圈门工具 Automatic 和Snap-To门工具可用来设置 polygon和interval 门。 在这一节中，你需要先前所建立的 Simple Analysis 和 Manual Comp 实验。Creating Gates 这部分说明了在 Manual Comp E

16、xperiment 中怎么用 worksheet中的菜单栏来设不同的门：1、打开 Manual Comp Experiment2、把试管指向对准 Calibrite 样本下的 Pre Sort试管，如下图：3、在 FSC vs SSC点图上建一个 Autopolygon 门选中 worksheet菜单栏的( Autopolygon )工具。 在点图中点击粒子，一个门将会自动4、试管指示指向下一个试管，可以看到一些粒子在门外。5、选择 FSC vs SSC图的 Autopolygon 门， Delete按 Delete 键而不是 Backspace键，如果 Delete 键不工作的话，右击门，选

17、择 delete。这将会 激活 Delete键，下次就可以使用。精品文档精品文档6、在 FSC vs SSC点图上创建 Snap-To polygonSnap-To polygon 和autopolygon 门不同，Snap-To polygon 门自动重新计算。 可看见 Snap-To polygon 门的边框比较粗。7、把试管指示回到 Pre Sort 试管，注意门的变化。8、（可选） 用其它设门工具进行练习，在点图上去除Snap-To门，创建一个 Rectangle门和一个 Polygon 门（Editing Gates 这部分描述怎样移动和改变门的大小1、选中 FSC vs SSC点图

18、上的门，在每个顶点上会出现一个把手。2、移动选中的门 移动门的时候，选择门的边，而不是顶点，可看到门的标签随着门一起移动3、拖动其中的一个把手来改变门的大小在你移动或者改变 Snap-To门时，门将不会自动调准。你可以通过右击门的边，选择下 拉菜单中的重新计算。4、通过拖动门内的标签，可把标签拖到门外5、在门外点击，释放门6、关闭 Manual Comp Experiment.Subsetting PopulationsSimple Analysis Expriment 包括三个点图和一个 Population Hierarchy 。 Population Hierarchy 主要是用来查看各

19、个门内群体关系。精品文档精品文档在这里，你需要原来创建的 Simple Analysis Experiment ，在软件安装时，样本文件存在 于BDExportFCS 文件中。导入数据 在你进行分群前，需要含有数据的点图：1、通过双击来打开 Simple Analysis Expriment ，只有把实验打开时，你才能导入数据。2、选择 File Import FCSfiles 通常， D:BDExportFCS 文件出现，除非你原来改变过路径3、双击 4色文件，在双击 Calibrite beads 文件夹来打开。4、选择文件中所有的 FCS文件，点击 Import当导入 FCS文件时，需要

20、选择文件，而不是文件夹，可以通过Shift 和Ctrl键来选择多个甚至全部。Tube-001这样就增加了一个新的样本 Calibrite Beads ，含有四个带数据的试管。5、在 Calibrite beads 样本中，把试管指向6、在浏览框中选择 Tube-001 ，勾选 Inspector 中荧光参数前的 Log Checkbox 。精品文档精品文档7、对 Calibrite Specimen 实验的其它试管做相同的操作Defining and Subsetting Populations1、 Tube-001的FSC vs SSC点图上，建立一个 Autopolygon 门。新的 P1

21、群就在 Population Hierarchy 上出现。2、把标签 P1拖出 Autopolygon gate （点中 P1标签，拖出门外）。3、建立一个只显示 P1群的 PE直方图 右击直方图， 选择 show population P1 。在直方图上只显示 P1群体， 注意到直方图上所有 的点都是红色的，是 P1的颜色。4、PE直方图上，在 PE阴性峰上创建一个 Autointerval 门 精品文档精品文档Population Hierarchy 图上 P2群显示在 P1群下面。当你在一个群下创建一个门，新的群体 是原来群体的一个亚群。注意到 P2旁边的颜色框是一个十字叉，说明子群的颜

22、色仍旧是其母群的颜色。默认情 况下， Interval 和Quadrant门定义的群体一般不会被授予颜色。5、点击 FITC vs PerCP-Cy5.5 点图，显示 P2群体 在点图上右击，选择 show population P2 点图是空白的，因为 P2群体没有颜色，下面是给 P2群体设置一个颜色：1）双击 Population Hierarchy 前的颜色框2）选择一个颜色6、在 FITC vs PerCP-Cy5.5 点图上建一个 FITC 阳性的 Rectangle门。 扩展门的边越过 X 轴，可以包含有轴的粒子。因为点图显示的是 P2的群体，新的 P3群体是 P2群体的一个子集。

23、下面的步骤显示另一种建群体的方法。7、设置 FITC vs PerCP-Cy5-5 点图显示全部的粒子Tip 你也可以用 Inspector 来显示一个点图的群体层次结构。8、Population Hierarchy 中选择 P2群体，在 PerCP-Cy5.5阳性群体上画一个 Autopolygon 门。结 果如下，可以看出新创建的 P4群体是 P2群体的一个子集。精品文档精品文档在进行分群时为了避免错误，保持 Population Hierarchy 可视。在你改变群体的名字或者 颜色时，你还是可以选择群体。interval 和 quadrant门的特Gating Multicolor E

24、xperiments 下面的教程说明了在用人外周血进行淋巴细胞亚群分析时， 性。在这个实验中，细胞用 CD3 FITC, CD16+CD56 PE, CD45 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC, 和CD8 APC-Cy7 进行染色 进行这一步学习，您需要 6-color Experiment ( BDExportExperiment folder )。1、在 Practice folder. 中，导入 6-Color gating选择文件夹，选择 File Import Experiments ，在 BDExportExperiment folder 中定位6

25、-color gating 。选择文件，点击导入。2、双击实验，打开实验3/16+56/45/4/19/8 试管，如下图。3、展开 lymphocytes 样本，试管指向定位在在worksheet点图中就会显示数据4、在 CD45 vs SSC 点图上，单核细胞和粒细胞上画一个Rectangle门。Tip ：把门延伸过点图的轴，这样就包含在轴上的点。5、在 Population Hierarchy 中把门命名为 MNEs ( monocytes、 neutrophils 、eosinophils )，选 择P1，输入 MNEs ，enter。精品文档精品文档6、在 Population Hie

26、rarchy 图中右击 MNEs ，选择 Invert Gate 。 在Population Hierarchy 图上就增加了一个新的群体（不包含单核细胞、粒细胞和嗜曙红 细胞）。7、右击 FSC vs SSC点图，选择显示 population NoT （ MNEs ），结果如下图。8、在淋巴细胞上画一个Autopolygon gate (），在 Population Hierarchy 上把这个群体命名为lymphocyte ，结果如下图，淋巴细胞是 NOT MNEs 的一个子集。Identifying Lymphocyte Subsets下面就把淋巴细胞分为 T、B和 NK细胞。1、右击

27、 FSC vs SSC点图上的淋巴细胞门，选择Drill down 。一个新的 FSC vs SSC图出现，只显示淋巴细胞。在一张点图上定义了一个门后，通过 Drill down 就可以创建一个只显示门内群体的点图。2、在新的点图上，把 FSC换成 CD3 。3、在CD3+细胞上画一个 Interval gate（一般应用在直方图上，在点图上也适用），命名新的 群体叫做 T细胞。精品文档精品文档4、用类似的方法可以得到 B、NK 亚群5、按住 ctrl键，在Population Hierarchy 中选择 T 、B和NK ，右击，选择 Join Gates，在Population Hierar

28、chy图上就出现一个新的群体，是 T、 B、NK 细胞的总合。Calculating Compensation Using Instrument SetupBD FACSDiva 软件可以自动的计算光谱的重叠值，在进行补偿时，更加节约时间，更 加精确。下面介绍如何使用 Instrument Setup feature 。Setting Up Compensation Controls1、打开 Experiment_0012、编辑参数如果计算机与仪器相连， 打开 Specimen-001，把试管指针指向 Tube-001，在Instrument框中编 辑参数。如果脱机操作，选择 Exprimen

29、t 下的 instrument setting ，在 Inspector 中编辑参数。3选择 Instrument-Instrument setup-Create compensation controls 。 下面的对话框将出现4增加或者删除对照，定义标记特异性对照，或者可以改变补偿控制的顺序。5点击 OK精品文档精品文档6展开 Compensation Control specimen 来查看补偿对照。Creating an Instrument Configuration在Instrument Setup 中，下一步就是记录数据。 为了计算补偿， 首先要把 instrument conf

30、iguration 设置成符合记录数据的格式。1选择 Instrument-Instrument Configuration2在 Instrument Configuration 对话框中，选择 Add Configuration3在 Instrument Configuration 对话框中，输入 2 laser, 4 color ，点击 OK注意： 确认你输入的名字完全与图上的相符， 如果字符的空格或者大小写与例子不符， 在计 算补偿时，就会有一个错误信息。4在instrument configurations 列表中，选择 2 laser，4 color ，点击 Add Paramete

31、r键6次 instrument configuration 图应该如下所示：5命名 laser和 detector，输入每个参数的名字首先应该确定一个 Detector，再改变参数的名字。 可以通过查看其他的 configuration 来找到每 个参数合适的 laser和 detector。通过相应 column的下拉菜单来选择所对应的设置， 把参数的名字改为 FSC、SSC、FITC 、PE、PerCP和APC 。精品文档精品文档6 点击 okImporting Data and Calculating Compensation 现在已经设置好与我们试验相符的 confuguration

32、，接下来就是导入数据。可以用原来记录的 数据( Sample expriment )来计算补偿1选择 Practice folder ，从 BDExportexperiment folder 里导入 AutoComp Expriment 。 选择 File- Import- Experiment ，找到 AutoComp Expriment 文件夹，点击 Import 。 2双击 AutoComp Experiment 打开实验这个实验包含有一个 Compesation Specimen 和四个荧光参数的试管3双击 Unstained Control Tube ，打开对应的 worksheet

33、4 在 FSC vs SSC点图上，移动 P1门包含所有的阴性粒子5右击门的边框，选择 Apply to All Compensation Control 。6 双击第一个 Stained Control Tube ( FITC Stained Control )，在 worksheet 打开相应的点图。 7确定 P2门包含了所有的阳性颗粒。P2门是一个 Snap-To Interval 门，已经包含了所有的阳性颗粒。如果一些颗粒在门外，右击 门，选择 recalculate。8双击下一个 Stained control tube ，打开相应的 worksheet。9对下面的试管，重复 7和

34、8，当所有的门设定好后，你可以进行补偿计算了。 10选择 Instrument-Instrument setup-Calculate Compesation 。将会出现一个对话框，可以进行命名。11 对于新的补偿进行命名，点击 ok。精品文档精品文档一个新的设定， 包括了参数和标记信息，阈值和电压，计算好的补偿。 新的仪器设置储存在Setup catalog下。Calculating Compensation Manually在进行下面实验时，需要导入 Manual Comp Experiment ，进行手动补偿时不需要链接仪器。 Adjusting FITC Compensation这部分描

35、述了怎样计算 FITC 荧光的溢出，其他荧光也是类似的。2 在 FSC vs SSC点图上创建一个 Snap-To gate ，如下图1选中 Compensation Controls Specimen 样本下的 FITC Stained Control 管。3在worksheet上选择 FSC vs SSC点图，右击点图，选择 Show Populations P1 。4在FITC-A vs PE-A 点图上，画一个 FITC阳性的 Interval gate 。在Population Hierarchy view 图 上，进行重命名为 FITC Positive 。5在 Populatio

36、n Hierarchy view 图上右击 FITC Positive ，选择 Invert Gate ，重命名为 NOT (FITC Positive) population Negative ，如下图精品文档精品文档6 在 Inspector 框中显示补偿管，确定 Enable Compensation checkbox 已经被选择。7调节PE-%FITC 荧光补偿，直到， FITC阳性群体的荧光平均值与阴性对照的相同，如下图。8用同样的方法调节 PerCP-CY5-5-%FITC 、 APC %FITC 的荧光补偿，结果如下图。精品文档精品文档其他荧光通道可用相同的方法进行调节。Manu

37、ally Constructing a Compensation Matrix 进行补偿完毕后，可以拷贝这些设置来进行实验。1放大 Inspetor 框，这样就可以看到整个补偿网络。2在Browser框中，右击 FITC Stained Control 管，选择 Copy Spectral Overlap 。3展开 Calibrite Specimen ，可以看到五个试管。4选择 Calibrite Specimen 下的 5个管子，右击试管，选择 Paste Spectral Overlap。 在数据拷贝后，在浏览器中选择其中一个Calibrite Tube 。在 Inspector框中，可

38、以看到 FITC 的补偿网络。如下图5轮流拷贝其它的 Spectral Overlap settings ，粘贴到这五个试管。当完成后，结果应该如下图精品文档精品文档在进行补偿之后，就可以用相应的条件进行样本检测Expriment 、 Template、 Panel Template、 Analysis Template 、Tip：可以进行导出和导入的模版：Settings、 FCS Files。Exporting Experiments1 在浏览框中选择 experiments2 选择 File Export Experiments.3 在 Export Experiments 对话框中，进

39、行合适的选择，点击 OK 。Importing Experiments1 选择 File Import Experiments.2 在对话框中选择实验文件夹或者 Zip 文件夹。3 选择需要的文件，点击 Import 。精品文档精品文档Exporting Experiments as Templates1右击experiment， choose Export Experiment Template ， Export Wizard dialog 出现。 2输入 template type 和模板名字（模版名字是进行区别的唯一标志），点击next3下面是一些可选项进行选择后，点击Finish 。I

40、mport a Template 根据已经储存的模板来建立一个实验（不能用快捷键） choose Experiment New Experiment or press Ctrl-E.出现 Experiment Templates dialog ，进行选择你所需的模板， 最多可建立 50个拷贝（实验拷贝）Exporting a Specimen as a Panel Template1Right-click the specimen 、 choose Export Panel Template ， Export Wizard dialog 出现。2选择你 panel所需要的 global wor

41、ksheet ，点击 next。 3选择 template type ，输入名字，点击 next。 4下面是一些可选项，点击 Finish。Importing a Panel Template选择 Experiment New Specimen or press Ctrl-M ， Panel Templates dialog出现，选择方式与导 入模板类似。进行选择，最多 50 个拷贝（样本拷贝）利用 Panel Template（包含有实验的仪器设置，分析方式）可对其他样本进行分析，但是样 本中所包含的试管数必须同。右击 specimen，选择 Apply Panel Analysis ，出现

42、 Panel Template dialog对话框，进行选择，点击 OK 。Exporting a Analysis Template1 Right-click an Analysis icon （ ）, 或者含有的tube或者 global worksheet ， chooseExport Analysis template 。 Export Wizard dialog 出现。2选择 template type ，确定名字，点击 next。3下面是可选项，点击 ok。Creating a Tube with a Predefined Analysis Template精品文档精品文档1Choose Experiment New Tube or press Ctrl-T 。2Analysis Templates dialog 出现，进行选择，点击 OK 。最多进行 50个拷贝( Tube数)。Creating Specimen- or Tube-Specific Settings1 右击浏览框 Cytometer Settings 图标 ( ) ，选择 Export to the Instrument folder 。2 输入文件名称，点击 Export.3 默认情况下文件会储存在 D:BDExportInstrument 中。Import