人类免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp41的基因重组表达解析

1、人类免疫缺陷病毒I型包膜糖蛋白gp41的基因重组表达【摘要】目的 基因重组表达(HIV-1 gp41)抗原，并研制一种快速、简便、灵敏性高、特异性强的国产HIV-1免疫检测试剂。方法 选用HIV-1型BH10毒株的包膜糖蛋白gp41的部分基因(6977-7497),重组在PBV221表达 载体上。表达产物通过15%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳初步分离纯化，根据RF值，切下含特异蛋白的胶带，以 Wester n blot法转移在硝酸纤维素膜上；免疫 血清法检测合格者制备的抗原检测条带，经国家标准参比血清检测。结果 获得1株含HIV-1 gp41基因的重组质粒，其蛋白的特异性表达为8%经HIV-1阳性

2、血清检测和国家标准参比血清检定，该表达蛋白灵敏性、特异性均为 100%结论(1)可以选用单一的gp41作为HIV-1感染初筛试剂的抗原。(2)表 达载体PBV221其表达的目的蛋白为非融合蛋白，作为试剂中的抗原，可降低检 测中的非特异性。(3)该试剂是一种简便、特异、灵敏性高的试剂。【主题词】HIV-1 基因重组 gp41 免疫检测试剂Expressi on of recomb inant HIV-1 en velope glycoprote in gp41TENGZhip ing, LI Degui, GAO Lia nshe ng, et al. I nstitute of Virolog

3、y, Chi nese Academy of Preve ntive Medici ne, Beiji ng 100050【Abstract 】 ObjectiveTo con struct and express HIV-1 env gp41gene for devel oing a simple and rapid test for HIV-1 in fecti on.Methods HIV-1 env gp41 gene of BH10 strain (nt6 977-7 497) was con structed into express ing vector pBV221 and e

4、xpressed in E. Coli HB101. The expressed protei ns were purified on 15% SDS-PAGE, the specific protein gel was cut dow n, tran sferred on to n itrocellulose membra ne and sta ined with pon ceau for 10 minu tes. The membra ne was detected with positive and n egative serum respectively. The membra ne

5、was blocked with block ing buffer and cut into 2 mm of each strip and fixed into the well of thin plastic plate.Results We obta ined astra nd plasmid express ing HIV-1 env gene and the prote in.Con clusi onThe results showed that:(1)HIV-1 env gp41 prote in can be used to detect HIV-1 an tibody in se

6、rum of in dividual; (2)The expressed protein is a nonfusion protein and has high specificity and sen sitivity to HIV-1.【Key words 】 HIV-1Gene recomb in ati ongp41 Immunedetect ion reage nt人类免疫缺陷病毒（HIV）在感染后的24周，血清中出现HIV特异性抗体 ：1应用免疫血清学方法，早期可检出抗核心蛋白p24及其前体p55和gp41的抗体。随后可发现抗包膜糖蛋白的 gp120/gp160 的抗体，但随着病情的

7、进展 p24抗体会逐渐下降，甚至消失。根据HIV感染后的血清学变化，我们选择了gp41为HIV-1的诊断试剂抗原，对其基因进行重组在PBV221温控表达载体上，在大肠杆菌中表达。gp41位于HIV-1包膜糖蛋白的gp160的基因编码区，第四开放读码框架之 内，共含350个氨基酸残基，其前体为包膜糖蛋白的gp160,经蛋白酶裂解成gp120和gp41,分别形成成熟病毒颗粒的表面棘突和跨膜部分。位于表面的部 分，可刺激机体产生相应的抗体，本研究选用的gp41内的抗原决定簇，位于BH10毒株基因7 345-7 423，编码23个氨基酸残基。PBH1（质粒含有BH10的全基因，经Bgl U和Hind川

8、核酸内切酶消化，回收 的0.52 kb（6 977-7 497）基因片段重组在 PBV221表达载体上。PBV221表达载体全长为 3.66 kb ，含有很强的启动和终止密码及诱导表达基因，氨苄青霉素 为抗性选择标记基因，通过 BamHI与目的基因上的Bgl U酶为同工酶）和 Hind川酶切位点插入了目的基因。1 材料和方法1.1 材料 含有 HIV-1 BH10 毒株全基因组质粒为本室提供。基因表达载体PBV221由本所基因工程室赠送。核酸内切酶购自华美生物技术公司。0.45卩m的硝酸纤维素膜购于BioRAD公司。SPA辣根过氧化物酶结合物为本室标记。底 物TME购自Gen emed Bio

9、tech nologies 公司。HIV抗体阴性对照血清来自正常 人血清，用蛋白印迹及ELISA法检测，HIV-1+2抗体均为阴性。HIV-1抗体阳性 对照血清来自我国云南吸毒 HIV-1感染阳性者血清，经ELISA和Western blot 法检测抗体为阳性，56C30分钟灭活，作为阳性对照。国家 HIV标准质控参比 血清，购于中国药品生物制品检定所。1.2 方法51.2.1 HIV-1 gp41抗原基因的重组 将PBH1（毒株基因组DNA用核酸内切酶 Bgl U消化酶切，0.8%低融点琼脂糖凝胶回收1.43 kb DNA片段（6 977-8 407），经BamHI酶解PBV221质粒载体，

10、S1核酸酶分别修平Bgl U粘性末端和 PBV221载体的BamH酶解的粘性末端，成为平头。Hind川核酸内切酶酶解上述 修平的片段的载体片段，低融点琼脂糖回收 0.52 kb 片段，回收的 0.52 kb 基 因片段经T4连接酶连接，重组在PBV221的载体上。重组质粒转化到致敏态的 HB101受体菌，LB固体培养基上培养过夜。1.2.2 重组质粒的鉴定核苷酸顺序分析挑选单菌落LB培养液中培养，小量质粒提取，经Hind川酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。提取纯化重组的阳性质粒， ABI 核酸自动测序分析仪进行序列分析。1.2.3 重组质粒 gp41 基因的表达 挑选经测序分析重组正确的阳性单

11、菌落， 接种于5 ml加氨苄青霉素的LB培养液，30E震荡过夜，次日晨转到50 mlLB 培养液中，30E摇菌测0D值（约为0.6），调温到42C诱导4小时，使蛋白表 达，4 000 r/min 离心20分钟，收集细菌，沉淀加 TG缓冲液（10 mmol Tris- HCl，10%甘油）100 C煮10分钟，样品于15%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，样品一 式两份，一份考马斯亮蓝染色表达分析蛋白产物，另一份分析抗原性。1.2.4 重组表达 gp41 蛋白抗原性的检测 按 Western blot 法转移到硝酸纤维 素膜上，丽春红染色检测转移的蛋白，将载有抗原蛋白的硝酸纤维素膜4C封闭过夜（封闭液；

12、 0.01 mol/L PBS pH7.4 ， 0.2%Tween-20， 3%牛血清蛋白 ），以 不同稀释度的 HIV-1 抗体阳性血清免疫血清法检测表达蛋白的抗原性。加阳性 血清：37C, 30分钟；PBS洗 10秒钟X3次加HRF标记的二抗；37C, 30分 钟，PBS洗 10秒钟X3次加入底物液：2滴底物缓冲液加入1滴底物液（H2Q+TMB观察结果。1.2.5 检测试剂条的制备（1）抗原的制备：取经检定阳性的甘油保存菌种 1 支，接种到 5 ml 加氨苄青霉素的LB培养液中，30C振荡过夜。次日晨转入50 mILB中,30 C振荡约4 小时，测QD值在0.5，调温到42C，继续培养4小

13、时，诱导蛋白的表达。4 000 r/min离心20分钟，收集细菌。将沉淀按1 : 16的原体积加入30卩lTG buffer（10 mmol/L Tris-HCl, pH7.6, 10%甘油）充分混匀，加 30 卩 l 蛋白样品buffer（3% 蔗糖， 2%SD，S 5%巯基乙醇， 20 mmol/L Tris-HCl,pH8.0, 溴酚蓝）混 匀，煮沸 10分钟，备电泳用。（2）15%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白：制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶板30 cmx 20 cm，按每厘米1卩l加上述制备的样品，15 mA电泳16小时。根据标 准蛋白分子量 marker 和 Rf 值及溴酚蓝下缘长度

14、计算 gp41 的位置，上下各宽 1 cm,切下特异的胶带。按 Western blot法转移到硝酸纤维素膜上，丽春红染色3分钟，检测转移蛋白效果。置于封闭液中，4C过夜。膜封闭后，自然干燥， 切割成 3 cmx 10 cm 的条带。双面胶将抗原条固定在反应槽内，每槽 1 条。（3）抗原条特异性和敏感性的检测：按国家 HIV-1 标准，参比血清试剂盒操 作说明，检测制备的抗原条。2 结果2.1 Hind川内切酶酶切鉴定的重组质粒，经 0.8%琼脂糖凝胶电泳比较，获得 了 4.1 kb 的重组质粒 （1 ， 2）。2.2 重组质粒经373A型核苷酸序列测定仪测定（反向测序）核酸序列，分析 含有g

15、p41抗原决定簇的编码23个氨基酸残基的264-334核苷酸序列。GAT CAA CAG CTC CTA GGG ATT TGGAsp Gln Gln Leu Leu Gly Ile TrpGGT TGC TCT GGA AAC CTC ATT TGCGly Cys Ser Gly Lys Leu Ile CysACC ACT ACT GTG CCT TGG AACThr Ala Ala Val Pro Trp Asn1 重组质粒的鉴定 (0.8%琼脂糖凝胶电泳 )1.DNA/Hind 川 Marker; 2.PBV221; 3.重组质粒(pBV221+0.52 kb); 4. 重组质粒经Hi

16、nd川酶切Fig.1 Confirmation of the recombinant plasmid(0.8% agarose gel electrophoresis)1:DNA/Hi nd 川 Marker. 2:Plasmid pBV221.3:Recombi nant plasmid(pBV221+0.52 kb). 4:recombinant plasmid digested by Hind2 HIV-1 gp41 pPBV221 重组质粒的构建Fig.2 Construction of plasmid of HIV-1 gp41 gene and pBV221 vector2.3 H

17、B101受体菌内，温控诱导表达的蛋白经 15%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳纯 化分离(4) 。考马斯亮蓝染色，可见 19 300 的蛋白，经分光光密度扫描仪测定 显示特异性的表达量为 8.6%。2.4 重组表达gp41蛋白抗原性的检测结果 分别以阳性血清和1 : 200、 1 : 20不同稀释度的阳性血清和1 : 1 000的免疫酶，应用免疫血清法检测，3， 3-二氨基联苯胺显色可见棕色的阳性条带，阴性对照则无其他的条带 (5) ， 应用国家标准参比血清检测结果 (6) 可见 8 个阳性， 8个阴性，与标准结果一 致。3 讨论HIV感染人体后，出现p24、gp41、gp120等抗体，gp41抗体能

18、持续稳定存 在，p24随疾病的发生而下降。因此，HIV-1感染的检测主要是HIV-gp41抗体 的检测。随着计算机在生物技术中的应用，对于抗原蛋白表面活性亲疏水性等 理化性质及生物学功能作出综合分析判断，由此对抗原决定簇的定位作出理论 预测。因此，本文只选用 gp41 的单一抗原决定簇基因片段进行重组表达，既可 获得稳定的反应结构域，又保留了原有的生物学活性。重组的目的基因与载体 之间有适宜的阅读框架和稳定的结构，因此， 42 E温降。因此，HIV-1感染的 检测主要是 HIV-gp41 抗体的检测。随着计算机在生物技术中的应用，对于抗原 蛋白表面活性亲疏水性等理化性质及生物学功能作出综合分析

19、判断，由此对抗 原决定簇的定位作出理论预测。因此，本文只选用 gp41 的单一抗原决定簇基因 片段进行重组表达，既可获得稳定的反应结构域，又保留了原有的生物学活 性。重组的目的基因与载体之间有适宜的阅读框架和稳定的结构，因此，42C温3经373A型仪器测定重组质粒核苷酸序列Fig.3 Nucleotide sequence of recombinant plasmid415% SDS-PAG凝胶电泳分析重组表达蛋白1:蛋白分量标记；2, 3:宿主菌；5, 6:重组表达样品；4, 7: pBV221载体对照Fig.4 15%SDS-PAGE analysis of expressed recom

20、binant protein1:Protein molecular weight marker. 2,3:Host bacteria. 5,6:Expressedprotein sample. 4,7:Vector pBV221 control5 重组表达蛋白抗原性测定 HIV-1 阳性血清1 : 20、1 : 200稀释，1 : 1 000免疫酶血清学检测（+为阳性结果，-为阴性对照）Fig.5 Antigenicity detection of expressed protein HIV-1 positiveserum dilution 1:20、1 : 200, 1 : 1 000 se

21、rum dilution forimmunoenzyme assay (+:Positive results. -:Negative control)6 国家标准参比血清检测 HIV1、 2、 5、 7、 8、 10、 11、 12阳性； 3、 7、 9、 12、 20、 24、 27、 28阴性 Fig.6 HIV detection with national standard reference serum1， 2， 5， 7， 8， 10， 11， 12: Positive. 3 ， 7， 9， 12， 20， 24， 27， 28:Negative本课题受国家“八五” (编号： 85-916-03- 02) “九五”攻关项目资助 (编号： 96-906-03-16)作者单位： 100050 北京 中国预防医学科学院病毒学研究所 (滕智平 曾 毅) ；科技服务公司 (李德贵 高连胜)参考文献 1 Joller-Jemelka HI, Joller PW, Muller F, et al. Anti-HIV IgM antibody analysis during early manifestations of HIV infe