医学免疫学实验：流式细胞术的基本原理及应用

1、流式细胞术的基本原理及应用 Dou Huan Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine Medical School, Nanjing University FCM FCM PrinciplesPrinciples FCM ApplicationsFCM Applications Spleen T cells detection Spleen T cells detection Flow Flow CytometryCytometry PrinciplesPrinciples Flow Flow CytometryCytometry Princi

2、plesPrinciples n流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种快速、 准确、 客观的检测直线流动状态中单个细胞多项物理及生物学特性，加以分 析定量的技术。 n检测速度快，分析样本量大在极短时间内可分析大量 细胞，这是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上 万个细胞的速率进行测量。 n可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体 组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。 流式工作原理流式工作原理 通过激光激发高速流动的单个细胞 所携带的各种荧光素和荧光染料，并 检测由此产生的散射光和荧光染料的 发射光，通过各种光信号的强弱来反 映细胞

3、的各种特征。 流式细胞仪工作原理示意图 Flow Flow CytometryCytometry PrinciplesPrinciples 前向角散射光（FSC） 当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同 轴的称前向角散射光信号（FSC）。 FSC一般表征细胞相对大小及其表 面积。 侧向角散射光（SSC） 与激光束垂直的称为侧向角散射光信号（SSC）。 SSC一般表征细胞粒 度及细胞内相对复杂性。 散射光信号，散点图 (Dot Plot) n 某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出 波长比照射光波长长的光线-即荧光。而这些受激发 后能产生荧光的物质称为荧光素。 单

4、参数荧光直方图单参数荧光直方图双参数荧光散点图双参数荧光散点图 荧光补偿原理 n 荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中， 纠正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即 从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。 n 荧光素光谱的重叠尽量减少。 1973年BD公司推出世界第一台商品化的流式细胞仪FACS I 流式细胞仪的组成 n液流系统 n光学系统 n电子系统 FCM FCM PrinciplesPrinciples FCM ApplicationsFCM Applications Spleen T cells detection Spl

5、een T cells detection FCM ApplicationsFCM Applications 细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异 性抗原 细胞活性 细胞内/外细胞因子 激素结合位点、细胞受体 蛋白磷酸化 pH值 钙离子浓度 细胞膜电位、线粒体膜电 位 FCM ApplicationsFCM Applications FCM ApplicationsFCM Applications 细胞周期&倍体分析 碘化丙啶(Propidium ，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和

6、双链DNA结 合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙 啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情 况，可以进行细胞周期分析。 FCM ApplicationsFCM Applications 细胞凋亡 细胞凋亡，又称为程序性细胞死亡 (Programmed Cell Death) 是机体主动 的、高度有序地清除无用细胞的过程。和细胞坏死(Necrosis) 相区别，坏死是 细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。 磷脂酰丝氨酸 (PS) 的检测：早期凋亡 正常细胞（Normal Cell） 膜内-磷酯

7、酰丝氨酸（PS） 膜外-磷脂酰胆碱、鞘磷脂 凋亡细胞（Apoptotic Cell） 膜内-磷酯酰丝氨酸（PS） 膜外-磷脂酰胆碱、鞘磷脂、PS Annexin V，PI 双染法检测细胞凋亡 FCM ApplicationsFCM Applications 细胞增殖分析CFSE标记法 l 荧光染料CFSE， 是一种良好的细胞标记物。当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞 质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一 半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现 象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强

8、度不 断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。 FCM ApplicationsFCM Applications 免疫学研究 FCM ApplicationsFCM Applications 根据功能，淋巴细胞主要分为： T淋巴细胞（CD3+），与细 胞免疫有关总T和总B可以用来判 断某些免疫缺陷和自身免疫性疾 病； B淋巴细胞（CD19+）与体液免疫 有关； NK细胞（CD3-CD16+CD56+）， 行使免疫监控功能， 能够介导对 某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的 细胞毒性作用。 FCM ApplicationsFCM Applications 调节性T细胞（Tregs） Tregs在抑制

9、重要的病理性的免疫反应中，如：过敏反应、 自身免疫病、 免疫-炎症状况等有重要影响。 表面标志：CD4，CD25，CD127，FOXp3 FCM ApplicationsFCM Applications 干细胞研究 北京时间10月8日，2012年诺贝尔生理学或医学奖揭晓，约 翰戈登（John B. Gurdon）和山中伸弥（Shinya Yamanaka） 获奖，获奖理由为“ 发现成熟细胞可被重编程变为多能性” 。 FCM ApplicationsFCM Applications 干细胞研究FCM FCM应用 胞内 胞外 上清 细胞培养 分化 寻找生物标记 Stem Cells定性 Side

10、Population 分析 Stem Cells分离 FCM ApplicationsFCM Applications 毒理药理实验 微核分析 正在复制的细胞由于出现染色体断裂或者纺锤装置功能 异常而导致有丝分裂染色体分布紊乱，分裂后期这些染 色体碎片或整条染色体遗留在细胞液中，即所谓微核 (micronucleus，MN) 传统的微核计数方法枯燥、耗时，而且易受操作者主观 因素影响，流式细胞术计数是一种高通量、客观、灵敏 和自动化的替代方法。 微核具有边缘清晰和特异染色的 特征，尤其适用于FCM技术进行自动化计数。 FCM ApplicationsFCM Applications FCM F

11、CM PrinciplesPrinciples FCM ApplicationsFCM Applications Spleen T cells detection Spleen T cells detection （FicollFicoll密度梯度离心法密度梯度离心法） FicollFicoll密度梯度离心法密度梯度离心法 脾脏细胞混悬液中各种有形 成分比重存在差异， 利用 比重为1.077、近于等渗的 Ficoll-hypaque混合液（又 称淋巴细胞分离液）做密度 梯度离心时，各种成分将按 密度梯度重新聚集。 红细胞及其他细胞 和死细胞碎片 Ficoll分液层 淋巴细胞层 PBS覆盖层 S

12、pleen T cells detection Spleen T cells detection 实验步骤 1. 取小鼠脾脏组织块，置于装有PBS的平皿内； 2. 取200目不锈钢过滤网，用注射器内芯研磨脾脏， 磨碎后加入少量PBS，吹打至混合均匀，转入 15ml 离心管，定容至10ml，1500rpm，离心 5min，弃上清，用2ml PBS重悬细胞； Spleen T cells detection Spleen T cells detection 3.将2mL淋巴细胞分离液（室温）预先加入到流式管中， 然后将细胞悬液缓慢加入到此流式管中（切记缓慢）； 4.2200rpm， 25，离心25

13、min，注意，离心机一定要慢 升慢降； 5.用吸管吸取中间层的灰白细胞，放入另一只流式管中， 加 2ml PBS，1500rpm，离心5min，弃上清，加入10L 流式抗体，混匀，RT，避光染色15min； Spleen T cells detection Spleen T cells detection 分组：Unstaining group(NEG) CD3 single staining group(CD3) CD4 single staining group(CD4) CD3/4 double staining group(双) 7. 加入500 L PBS，混匀， 1500rpm离心5min， 弃上清； 8. 重复步骤7； 9. 加入100 L 1%PFA，4避光保存，待上机检 测。 Spleen T cells detection Spleen T