BPG层析柱实用标准装柱流程的要求规范

1、实用标准文案操作标准目的：为了使 BPG300 层析柱装柱过程可重复，并能够得到较好的柱效，故建立 此操作规范。范围：配合 ?KTA process 系统进行有效的蛋白质纯化操作。 责任人：层析工序操作人员标准操作程序：1 基本术语概念 填 料 因 子 ( Packing Factor, PF )： 指 在 在 装 柱 过 程 中 ， 用 低 流 速 ( 如60cm/h )对填料进行沉降压缩得到的调料高度和最后装柱完成时填料高度柱高)的比值，GEHC 生产的各种常见填料的 PF 参见 GEHC AxiChrom 300-1000 columns UserManual 28-9562-89 Ed

2、ition AA ；线性流速( linear flow rate )：单位时间内液体流经的直线距离，常用 cm/h 表示；体积流速( volume flow rate )： 单位时间内液体流经的空间容积，常用精彩文档实用标准文案ml/min 表示；换算：2 准备工作2.1 检查层析柱的完整性，所带配件，是否水平（用水平仪矫正） ，是否清洁 （如有污染应进行清洗） 。2.2 确定所用填料及其特性、浓度等 以 DEAE Sepharose Fast Flow 填料为例，其填料因子（ PF）为 1.15 ，新填 料（ slurry ）浓度为 75% （保存于 20%乙醇中），耐压 3bar。2.3

3、确定放大后的工艺参数以 XX 生化制药股份有限公司的放大工艺为例，中试工艺参数：柱高 h=10cm ；体积流速 v1=3ml/min ；柱内径 d=1.6cm.即，线性流速 v2=v1/s 柱 =3/（3.14 0.82） cm/min=1.5 cm/min；样品与填料接触时间 t=h/v2=10/1.5min=6.67min ；在工艺的线性放大中 h 、v2 和 t 均不变，则可保证样品出峰的位置（洗脱时间）和形 状不变。使用 BPG300 层析柱进行放大的工艺参数： 装柱体积 V 柱= S 柱h=3.14 1.52 1L=7L ； 装柱需要 slurry 体积 V slurry =V 柱P

4、F/C slurry 以 DEAE Sepharose Fast Flow 为填料， 则， Vslurry =7 1.15/0.75L=10.73L ； 装 入 柱 中 的 slurry 高 度 Lslurry =V slurry /S 柱 =10.73/(3.14 1.52)dm=1.52dm=15.2cm.3 管路安装3.1 层析柱管道和配件安装3.1.1 卸下柱子顶部和底部的盲堵垫圈，旋松密封调节器，用纯水或20% 乙醇充分浸润柱内壁和柱头 O 型圈；精彩文档实用标准文案3.1.2 用扳手对称卸下支持杆连接到法兰的螺丝，并通过旋转高度调节手柄将 柱头旋至最高处，在柱头顶部依次安装压力表和

5、四路二通阀，在柱底安装四路 二通阀；3.1.3 在顶部四路二通阀上横向连接一根细管，另一端连至 ?KTA process 上端连接口 COLUMN TOP，同时从柱底四路二通阀横向接出一根细管至?KTA process 的下端连接口 COLUMN BOTTOM 。图 1 、BPG300 层析柱安装示意图3.2 层析柱下端筛网排气泡3.2.1 连接两根足够长的细管到 ?KTA process 进样泵的 A1 和 B1 进口，两管 另一端均放入纯水中；精彩文档实用标准文案3.2.2 从 A1 泵入纯水：打开 UNICORN 软件，在 system control 窗口点击 manual valve

6、s InletA ，选择 inletA1 ， insert ； InletB ，选择 closed ， insert ；Column ，选择 upflow ，insert ；Pump Flow ，设定流速 60L/h ， 点击 execute 运行程序充水至 BPG 柱中 2-3cm 左右， pause ，清除下端筛网 中的空气，用注射器吸出筛网中残留的气泡。4 装填料4.1 准备填料 所用填料为 DEAESepharose Fast Flow ，装置的是保存于 20% 乙醇中的新 slurry ；4.2 卸下柱头，用搅拌棍引流加入混匀的 slurry 至 15.2cm 处，再加入纯水至 40

7、cm 左右，充分搅拌混匀，同时避免挤压筛网和柱壁，静置使填料界面至少 低于 38cm ；4.3 在 system control 窗口点击 manual valves InletA ，选择 inletA1 ， insert ；InletB ，选择 closed ， insert ；Column ，选择 downflow ，insert ； Pump Flow ，设定流速 60L/h ，点击 execute 运行程序将柱头上端筛网充满 水以除去气泡，再装上柱头，用密封调节器固定柱头，拧紧螺丝；4.4 在 system control 窗口点击 manual Pump Flow ，设定流速为 42

8、L/h （ 60cm/h ），进行填料的沉降，待填料高度降至 14cm 左右，将密封调节器 旋至全松，将柱头快速调至距离填料 3-4cm 处，将密封调节器旋至半松，将 柱头快速调至滤网距离填料 1-2cm ，旋紧密封调节器，再设定高流速（如 150L/h ），继续压缩填料，最后再调节柱头至 10cm 。整个过程一直有流速， 泵速不能停5 柱效测定精彩文档实用标准文案图 2 、柱效测定示意图5.1 平衡将 A1 接口细管放入 0.4MNaCl 溶液中，将柱顶端四路二通阀调至管路与大 气相连状态，在 system control 窗口点击 manual valves InletA ，选择 inle

9、tA1 ，insert ；InletB ，选择 closed ， insert ；Column ，选择 downflow insert ；Pump Flow ，再设定高流速（如 150L/h ），点击 execute 运行，排 气泡，再将阀调至管路与柱头相连状态，平衡 3-5 个柱体积至电导曲线稳定， 点击 END ；5.2 上样5.2.1 将 B1 接口细管放入 2M NaCl 溶液，柱顶端四路二通阀调至管路与大气 相连状态，在 system control 窗口点击 manual valves InletA ，选择 Closed ，insert ； InletB ，选择 InletB1 ，

10、 insert ；Column ，选择 downflow insert ；Pump Flow ，设定高流速（ 150L/h ）点击 execute 运行，排气泡， pause ；精彩文档实用标准文案5.2.2 在 system control 窗口点击 manual Other End_Timer ，选择 Acc. Volumn, Timeout 设上样量为 70mL （ 1% 柱体积）；Pump Flow ，设定上 样流速 60L/h ，点击 execute 的同时将柱顶端四路二通阀调至管路与柱头相 连，完成上样；5.3 洗脱5.3.1 将柱顶端四路二通阀调至管路与大气相连状态，在 syst

11、em control 窗口 点击 manual valves InletA ，选择 inletA1 ，insert ；InletB ，选择 closed ， insert ； Column ，选择 downflow ， insert ；Pump Flow ，设定高流速 （ 150L/h ）点击 execute 运行，排气泡，同时将管路充满 0.4M NaCl 溶液， 调流速至 21L/h （ 30cm/h ）；5.3.2 待流速稳定后，在 system control 窗口点击 manual valves Injection Mark ，insert ，点击 execute 的同时将柱顶端四路

12、二通阀调至管路 与柱头相连，开始洗脱，在一个柱体积左右，电导检测下将产生目的峰。5.4 测柱效在 Evaluation 窗口中，选择实验保存的结果，在结果图中点击鼠标右键，选 择 Properties ， 点 击 Clear ， 并 选 中 Cond_102 ， 点 击 OK 。 回 到精彩文档实用标准文案Evaluation 窗口，选择积分按钮，在弹出窗口中，选择 Cond_102 ， peak window 中调整积分的范围， 并在 Reject Peaks 中，填 Peak must be one of 1 largest ；确定后，在积分结果窗口，点击右键，选择 Properties ，在 peak table 选项中，勾选 Plate Height （HETP）和 Asymmetry 。确定后即 可计算得到计算理论塔板高度 HET