HIV1跨膜蛋白gp41核酸疫苗的构建及其免疫原性研究

1、山西农业大学硕士研究生毕业论文HIV-1跨膜蛋白gp41核酸疫苗的构建及其免疫原性研究 研究生姓名： 辛 苏 文立峰 导 师： 马 海 利任家教 授 金 宁 一 研究员 学 科专 业： 预 防 兽 医 学 研 究 方 向： 动 物 传 染 病 诊 断 与 防 治中国山西太谷2007年6月 The Construction and Immunogenicity of Transmembrane Protein gp41 Nucleic Vaccine of HIV-1 Graduate name : Xin SuWen Graduate tutor : Prof. Ma haili Resear

2、cher.jin ningyi SubjectMajor: preventive veterinary medicine Research subject: the diagnosis and prevention of animal infectious diseases TaiGu ShanXi ChinaJune, 2007目 录摘 要2前 言3材料与方法10 1 试验材料10 2 试验方法12 2.1 基本实验操作方法12 2.2 重组质粒的构建16 2.3 重组质粒转染哺乳动物细胞17结果与分析19 1 重组质粒的酶切鉴定19 2 重组质粒表达gp41的检测19 3 ELISA检测特

3、异性抗体20 4 T细胞亚群数量的检测21讨 论22结 论28Abstract32致 谢33 摘 要人免疫缺陷病毒是引起获得性免疫缺陷综合症的病原体，其感染及引起的疾病对卫生组织保健资源和世界经济影响非常巨大。因此，研制具有良好免疫保护作用的预防性和治疗性疫苗具有重要的现实意义。gp41是镶嵌于HIV-1脂质双层中的一种跨膜蛋白, 是HIV-1的主要免疫原之一，在病毒感染过程中能够介导病毒脂膜与细胞膜的融合。因此，gp41已成为抗HIV 理想的药靶，其基因是研制HIV 核酸疫苗理想的靶基因。本研究利用分子生物学、免疫学等实验技术和手段进行了HIV-1跨膜蛋白gp41核酸疫苗的构建和实验性免疫学

4、研究。首先用PCR法获得gp41全基因，然后将其克隆到真核表达载体pIRES中，构建重组质粒pIRES-gp41。将此重组质粒转化感受态，酶切鉴定正确后，将其转染BHK-21细胞，结果表明能成功表达了gp41蛋白。小鼠免疫试验结果显示其具有良好的免疫原性，既可刺激小鼠产生体液免疫，同时又可以刺激小鼠产生细胞免疫。 总之，本研究利用先进的实验技术和手段，构建了HIV-1核酸疫苗，为开发新型HIV疫苗甚至进一步进入临床研究奠定了基础。关键词：HIV；核酸疫苗；gp41；pIRES；转染；表达 前 言人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）是引起获得性免疫

5、缺陷综合症（AIDS，即艾滋病）的病原体。艾滋病自1981年首次发现以来一直以惊人的速度在全球蔓延，至今人类仍然没有找到治疗艾滋病的有效方法。HIV通过使人体 CD4+ T细胞数量的进行性减少，细胞免疫功能的损害，最后导致的各种机会性感染、特殊的恶性肿瘤发生和中枢神经病变等1。当前，对艾滋病的研究主要集中在预防HIV-1感染疫苗的开发和对艾滋病患者病情的控制。通常认为HIV作用的主要靶细胞为淋巴细胞和单核巨噬细胞，经吸附、融合过程后进入宿主细胞。HIV基因组RNA经逆转录酶转录成前病毒DNA，在细胞核内再被整合酶整合进入宿主基因组，利用宿主细胞已有的基因复制和蛋白表达系统进行复制。在19世纪中

6、叶，该病毒突破了猿猴和人类的种间屏障在人和猿类中实现了交叉感染。由于不安全的注射和输液，使其在人与人之间发生感染流行。从而使病毒在经历数代繁殖后适应了人体的环境。今天，该病在非洲成为了头号杀手，在世界上则被列为第四大致死性疾病。HIV感染及引起的疾病对卫生组织保健资源和世界经济影响非常巨大2。因此，研制具有良好免疫保护作用的预防性和治疗性疫苗用于健康人群和感染者具有重要的现实意义。1 HIV/AIDS的流行情况艾滋病是人类健康和全球公共卫生的最重大挑战，严重危害社会进步与经济增长。世界卫生组织(WHO)和联合国艾滋病规划署(UNAIDS)在2005年底公布，目前全球存活艾滋病和HIV感染者(H

7、IV/AIDS)总人数已超过4000万，已死亡艾滋病病人累计超过了3 000万名。 据统计联合国艾滋病规划署和世界卫生组织2006年发表的年度全球艾滋病疫情报告显示3，全世界的艾滋病感染人数今年又创新高，突破4030万人，其中95%的人生活在世界欠发达地区。撒哈拉沙漠以南16个国家仍是艾滋病感染最严重的地区，感染率超过25，其中15岁以下的儿童患者达到6%。艾滋病在以惊人的速度蔓延着，现在每天有16000人感染上艾滋病，也就是说平均56s就有1人感染艾滋病4。进入90年代后，亚洲已成为疾病传播最快的地区之一，目前全球四分之一的新增病例出现在亚洲，亚洲目前正处于控制艾滋病蔓延的关键时刻。在中国，

8、截止2006年10月31日，累计报告艾滋病例，其中艾滋病病人40667例，死亡12464例，并且还有增长的趋势，其状况非常令人担忧。中国艾滋病感染人数每年以30%的速度增长，所面临的形势相当严峻，全人群感染率约0.07。我国31个省、自治区、直辖市都发现了艾滋病病毒感染者，遍布社会各阶层，据统计，内地艾滋病感染者将达到300万人，即每四百人中就有一名艾滋病带菌者。我国艾滋病流行情况比较复杂，入侵我国的艾滋病病毒类型有两个HIV-1、HIV-2，两个病毒类型间还有混合，防治工作及相关科研工作更需尽快展开。2 HIV的结构HIV隶属于逆转录病毒科（Retroviridae）慢病毒属（Lentivi

9、rus）5，成熟的HIV病毒为球形颗粒，直径为100200nm。外壳由嵌有膜蛋白的脂质双层膜构成，电镜下可见一个外包病毒囊膜的20面体结构，囊膜表面有72个规则排列的突起。这些突起由外膜gp120蛋白和跨膜gp41蛋白组成，外膜蛋白gp120的球状物突出于病毒包膜之外，另一端贯穿病毒包膜与运转蛋白gp41相接。HIV病毒的内层为蛋白质(结构蛋白)，内核也由结构蛋白组成。病毒粒子的中央为一个呈锐头致密的圆锥形核心，由核蛋白包裹的基因组RNA和病毒酶组成。病毒核心中含有两个单股RNA基因组和Mg2+依赖性逆转录酶和DNA聚合酶。HIV可分为HIV-1和HIV-2两个型，前者是引起爱滋病的主要病原体

10、。HIV-1的亚型分为M亚型组、O亚型组和N亚型组。HIV-2的生物学特性与HIV-1相似，但毒力较弱，引起AIDS病程较长，症状较轻。HIV-2与HIV-1核苷酸的同源性仅有45%。HIV-1和HIV-2基因变异率很高，它们的分离株彼此都不相同，这是由于病毒基因的突变、插入、缺失和不同病毒株之间的基因重组引起的。这两型病毒都引起相同的临床症状，但HIV-2的致病力较低。根据HIV-1感染细胞种类将病毒分为：巨噬细胞噬性病毒(M.tropic)、T细胞噬性病毒( T. tropic) 和双重噬性病毒(Dual.tropic)。M. tropic是无症状患者携带的主要病毒，主要利用CCR5，又称

11、为R5病毒株，在病毒传播中起主要作用。T.tropic主要利用的辅助受体为CXCR4，又称为X4 病毒株，Dual.tropic既可利用CCR5，又可利用CXCR4，被称为R5X4 病毒株。HIV基因组为两条相同的单股正链RNA，两单体由氢键组合成二聚体。HIV-1基因组长约9.3kb，HIV-2基因组长约9.7kb。基因组的5端有帽结构，3端有Poly(A)尾，两端具有逆转录病毒的基本结构基因LTR（长末端重复序列），中间有9个开放读码框架（ORF），3个结构基因，即编码核心蛋白的gag；编码外膜蛋白的env；编码病毒复制所需逆转录酶、整合酶、蛋白酶的pol。HIV-1还有2个调节基因tat

12、、rev和4个附属基因nef、vif、vpr和vpu，分别编码相应的蛋白5。（1）gag基因能编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白（P55），经蛋白酶水解形成P17、P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破坏。（2）Pol基因编码聚合酶前体蛋白（P34），经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需。图1 HIV结构示意图图2 HIV基因组结构（3）env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160、gp120和gp41。已证明HIV中和抗原表位在gp120 V3环上，V3环区是囊膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。gp120不含有穿膜区，它通过

13、与gp41的非共价结合而保持与细胞表面的结合状态，当gvp120与CD4+结合后，其构象改变与gp41分离，暴露出的gp41可插入细胞膜，由于膜融合，致使病毒核心被导入细胞。这两种分子对病毒感染是至关重要的。gp41与靶细胞融合，促使病毒进入细胞内。实验表明gp41有较强抗原性，能诱导产生抗体反应。（4）TaT 基因编码蛋白（P14）可与LTR结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译。（5）Rev基因产物是一种顺式激活因子，能对env和gag中顺式作用抑制序列(Cis-Acting repression sequance,Crs) 去抑制作用，增强gag和env基因的

14、表达，以合成相应的病毒结构蛋白。（6）Nef基因编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用，以推迟病毒复制。该蛋白作用于HIV cDNA的LTR，抑制整合的病毒转录。可能是HIV在体内维持持续感染所必需。（7）Vif基因对HIV并非必不可少，但可能影响游离HIV感染性、病毒体的产生和体内传播。（8）VPU基因为HIV-1所特有，对HIV的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少。（9）Vpr基因编码蛋白是一种弱的转录激活物，在体内繁殖周期中起一定作用。HIV-2基因结构与HIV-1有差别：它不含VPU基因，但有一功能不明的VPX基因。核酸杂交法检查HIV-1与HIV-2的核苷酸序列，仅40%相同。

15、env基因表达产物激发机体产生的抗体无交叉反应。3 机体对HIV感染的免疫应答人体的免疫系统是抗外部感染的最后防线，许多病原体感染人体，最终通过人体的细胞免疫和体液免疫而消灭。HIV感染能激发机体产生特异性的细胞免疫反应和对各种病毒抗原产生相应抗体。如HIV感染后可刺激机体产生囊膜蛋白（gp41、gp120）抗体和核心蛋白（p24）抗体6，7。这种抗体可在HIV携带者及艾滋病病人的血清中检测到，说明该抗体在体内有保护作用。HIV感染者可产生T淋巴细胞的细胞毒作用，如在感染脑部发现有T淋巴细胞浸润，说明T淋巴细胞在HIV感染中发挥抑制病毒复制的作用8。机体产生的抗体可以中和游离HIV病毒及已和细

16、胞结合而未进入细胞内的HIV颗粒。自然杀伤细胞和杀伤细胞通过抗体依赖性细胞毒性作用能溶解和杀伤HIV感染的细胞。机体的细胞免疫和体液免疫作用可在一段时间内控制HIV的复制及扩散。但是，由于病毒的变异和重组，可以逃脱免疫监视，不能被机体的免疫系统彻底清除。当机体的免疫系统被进一步破坏时，在某些触发因素的作用下，使HIV大量复制和扩散，最终导致艾滋病的发生9。 4 HIV入侵细胞的机制HIV病毒为逆转录病毒，遗传信息存在于两个相同的单链模板中。该病毒能结合人类具有CD4+受体的细胞，还能与神经表面的半乳糖神经酰胺结合，逆转录酶可将病毒RNA逆转录为DNA，然后DNA再与人类基因相整合。病毒DNA序

17、列被感染细胞及其子代细胞终身携带。HIV进入人体后能选择性的侵犯有CD4+受体的淋巴细胞，以CD4+ T淋巴细胞为主。病毒感染CD4+ T淋巴细胞后，首先引起细胞功能的障碍，细胞因子产生减少。当病毒在宿主细胞内大量繁殖时，导致细胞的溶解和破坏。HIV在细胞内复制后，可引起细胞膜的损伤，它可抑制细胞膜磷脂的合成从而影响细胞膜的功能，导致细胞病变。HIV还可以感染骨髓干细胞导致以CD4+ T淋巴细胞减少。当HIV感染的CD4+ T淋巴细胞表面存在的gp120发生表达后，它可以与未感染的CD4+T淋巴细胞CD4+结合，形成融合细胞，从而改变细胞膜的通透性，引起细胞的溶解和破坏10。gp41透膜蛋白能

18、抑制有丝分裂原和抗原刺激淋巴细胞的增殖反应，从而使CD4+T淋巴细胞减少。HIV感染后一般先出现CD4+ T淋巴细胞轻度至中度降低，该细胞总数可持续数年不变，反应病毒被免疫应答所抑制，历经一段时间，CD4+ T进行性减少，当病毒逃脱免疫抑制时可导致机会性感染和肿瘤的出现，以CD4+ T淋巴细胞数量及功能的进一步下降为特征11，当减少到一定程度，就会出现机会性感染。5 HIV药物和疫苗的研究现状2004年全球艾滋病感染人口总数达历史最高，艾滋病疫苗和药物的研发无疑具有极其重要的意义11。艾滋病药物研制则已从核苷酸类抗病毒药物发展到逆转录酶制剂和蛋白酶抑制剂复方制剂，加强我国自主研发艾滋病中药药物

19、已迫在眉睫。 高效抗病毒联合疗法（HAART）已显著降低HIV-1感染的发病率、死亡率及机会性感染的频率。然而尽管HAART能长期持续的抑制病毒的复制，最大限度的减少了循环病毒的水平，使CD4+ T淋巴细胞数量缓慢回升，但外周血CD4+ T淋巴细胞数量不能达到正常水平，长期存活的潜在感染的细胞仍存在。一旦中断这种药物治疗，将会出现血浆病毒的反弹，而且这种药物相当昂贵。由于药物的弊端和耐药株的产生影响艾滋病的治疗，所以预防HIV传播的最佳措施是研制安全而有效的预防性疫苗12传统的疫苗一般是被杀死的病原微生物或是毒力被减弱的病原微生物制成。但这些疫苗具有很大的弊端。虽然接种灭活疫苗的动物可以不发展

20、成艾滋病，但是并不能保护接种动物免受野生型病毒的再感染。并且该疫苗在安全性上存在问题，由于残留的HIV核酸可能具有感染性，作为免疫原接种于人，危险性很大。而且灭活苗诱导机体产生的主要为体液免疫，对那些寄生于机体细胞内部的病原微生物无作用。虽然减毒HIV活疫苗13，14既能诱导体液免疫，又能诱导细胞免疫，但组成减毒活疫苗的病毒株在免疫功能正常的人群中可以诱导对机体有利的免疫应答，而在某些免疫功能低下的人群，如艾滋病患者及接受化疗的癌症患者，这些原本安全的病毒株可能会引起感染的发生。而且某些病毒株会通过基因突变的方式恢复完整的毒力，从而对机体造成伤害。此外，病原微生物表面的抗原分子种类繁多，若其中

21、某些分子恰好与人体细胞表面的某些分子结构相同，那由此引发的免疫应答在杀伤病原微生物的同时还可能会杀伤正常机体细胞，产生自身免疫反应，同样对机体造成伤害。另外，病毒的突变或缺失会导致他们保护效率减弱。由于传统疫苗的不足之处，科学家们一直致力于研制新型的HIV疫苗，如重组亚单位疫苗15、重组活载体疫苗等16。目前研究的新型疫苗有以下几种：（1）亚单位疫苗包括纯化的病毒蛋白和重组的病毒蛋白，后者是将编码病原体的抗原蛋白基因与质粒拼接后插入细胞宿主，由宿主产生具有抗原活性的蛋白，经抽提纯化后成为基因工程亚单位疫苗，也称重组亚单位疫苗。常用的细胞宿主为大肠杆菌、酵母及哺乳动物细胞。蛋白亚单位疫苗也是艾滋

22、病疫苗研究的重点方向之一，已知HIV-1基因编码的各种蛋白产物大都有免疫原性，其中研究最多的是HIV膜蛋白（Env蛋白），这是因为此蛋白暴露在病毒颗粒表面，对免疫系统是很强的刺激原，所以，以重组膜蛋白为基础的亚单位疫苗一直是艾滋病疫苗临床试验的主角，但此类疫苗的缺点是基本不能引起机体产生细胞免疫。美国VaxGen 公司和美国军队于1999年4月用此类疫苗在美国和泰国开始进行3期临床试验。2003年2月，VaxGen公司宣布，他们研制的AIDS VAXgp120苗在历经3年的3期临床试验后，不能有效地预防HIV对人体的感染，最终宣告失败。但有关专家认为，其教训对发展新一代疫苗也是很有意义的。（2

23、）活载体疫苗应用重组载体制备疫苗是目前HIV疫苗研究的热点。从免疫学的角度看，重组载体疫苗是一种比较理想的疫苗系统，将含HIV 抗原决定簇的基因插入其它病毒或细菌的基因组中，利用这些病毒或细菌与相应的细胞表面受体的作用，将HIV抗原基因送入细胞，可以使这些基因的表达产物与MHC-I类分子或MHC-类分子结合，更好地呈递给免疫系统，同时用作载体的病毒或细菌本身可以作为佐剂加强免疫。（3）DNA疫苗HIV变异率很高，是疫苗研究的极大障碍。DNA疫苗的优点是可以对变异迅速的病原微生物提供交叉防御的作用，有助于克服由于病毒的变异而逃避免疫反应的问题。核酸疫苗与传统疫苗的区别主要是核酸疫苗的抗原蛋白是免

24、疫对象体内产生的，表达产物具有天然的构象，可按照正常的途径加工、修饰，再提呈给免疫系统，最终引起全面的免疫反应，整个过程与病毒的自然感染或接种减毒活疫苗相同，它的最大优点是具有亚单位疫苗的安全性及减毒活疫苗的高效性。核酸疫苗有希望成为预防和治疗艾滋病的有效免疫制剂。此外，它还具有成本低、易于联合免疫、具有同种异株交叉保护作用、无需冷藏、使用方便、能在大肠杆菌等工程菌内繁殖易于纯化等优点。（4） 表位疫苗近代免疫学研究发现，一个病原体引起免疫学功能的主要是抗原蛋白，而起决定作用的又是抗原蛋白上的抗原决定簇，抗原决定簇又是由数量不等的抗原表位组成。表位疫苗是以抗原表位为基础制备的疫苗。有效的免疫反

25、应通常包括有效的体液免疫反应和有效的细胞免疫反应，而这两方面的免疫反应又是由相应的中和抗原表位和T细胞抗原表位诱导的。机体的免疫应答包括体液免疫应答和细胞免疫应答17，18。体液免疫主要通过B细胞产生抗体发挥效应，而细胞免疫应答包括CD8+细胞毒性T淋巴细胞应答和CD4+辅助性T细胞应答，CD4+辅助性细胞又分为Th1和Th2亚群。Th1亚群主要分泌IL-2，IFN-和TNF-，Th2亚群主要分泌IL-4和IL-10等。在设计表位疫苗时，要根据机体对疾病的免疫应答特点及免疫保护机制，选择特异性B细胞表位、Th表位或CTL应答表位来定向诱导宿主的B细胞、Th应答或CTL应答；或者采用多种类型的表

26、位组合，同时诱发体液免疫和细胞免疫，并且通过选择Th1表位或Th2表位，诱导机体免疫应答向Th1或Th2型定向发展。首先根据优化的表位选择原则，对HIV-1全部表位进行扫描，选择已经确定的优势抗体表位和CTL表位9个，这些表位覆盖HIV-1 Env、Gag、Nef、Pol等主要结构和调节蛋白，所选表位在HIV-1不同流行株和亚型中，其序列保守性大于80%。同时，为使不同表位的空间构象互不影响，可以在表位之间添加多个柔性氨基酸序列19。根据预测，这种类型的间隔氨基酸残基可以诱导产生肽链的- 转角，从而更易从这里被酶切开而使相邻的两个抗原表位可以单独的呈递20。提高抗原基因免疫后的表达量21，22

27、，在抗原基因分子设计时引入Kozak序列；考虑到宿主细胞表达外源蛋白时对密码子的偏爱性，对密码子进行相应的优化。此外，将ER靶向信号引导序列及非MHC限制的通用性pan-DR Th细胞表位引入设计的疫苗抗原中，从而能够获得最佳的免疫23，24。抗原表位疫苗，尤其是多抗原表位疫苗可能协助研制有效的疫苗，用于诱导或阻止免疫治疗HIV-1突变的高水平多中和抗体。此外，不同抗原表位相结合的抗原表位疫苗能彻底阻止包括抗原表位突变序列的突变体逃脱。另一方面，强烈而持久的CTL反应与HIV-1感染及致病现象的保护相关联。抗原表位疫苗能诱导的有效CTL反应与预定义的中和表位和CTL表位复合物产生的抗体反应一样

28、明显。然而，近期的CTL免疫反应研究已确认了CTL“逃脱”假说。由于CTL抗原表位突变，抗原表位疫苗将引发巨大的CTL反应并阻止病毒逃脱CTL。无论如何，抗原表位疫苗25，26结合CTL抗原表位和中和抗原表位提出了抗HIV突变的新方法。国内外现在已投入了大量的资金和人力对艾滋病疫苗以及艾滋病病毒的分子生物学和免疫学进行研究，希望能早日遏止艾滋病在世界范围内尤其是发展中国家不断加速的蔓延趋势。本研究在前期研究工作的基础上，通过大量的查新，构建了表达病毒跨膜蛋白gp41的核酸疫苗，并对其进行了实验性免疫研究，为进一步研究抗HIV-1病毒的DNA疫苗提供可借鉴的技术数据。 材料与方法1 材料 1.1

29、 质粒、菌株和细胞 质粒pIRES，gp41基因 由军事医学科学院十一所病毒室保存；大肠杆菌DH5a，克隆载体的宿主菌 军事医学科学院十一所病毒室保存；BHK-21细胞系，军事医学科学院十一所病毒室保存。1.2 工具酶和主要试剂 内切酶EcoR I购自大连宝生物工程公司；T4 DNA ligase、Klenow大片段、Ex Taq酶、LA Taq DNA聚合酶、RNase，CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit 购自Promega公司产品；TRIZOL LS Reagent，Invitrogen公司产品；FITC（异硫氰酸荧光素）标记

30、的羊抗人IgG购自Promega公司；DNA Marker、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、DNA回收试剂盒、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基磺酸钠（SDS）、溴化乙锭（EB）、PEG8000、NaOH、NaCl、CaCl2、LiCl、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母抽提物等均为GIBCO、Invitrogen、TaKaRa、Sigma和华美生物工程公司产品； 其它常规生化试剂均为分析纯级。 1.3 主要仪器高速低温离心机，Hermle公司产品；高速常温离心机，Hermle公司产品；DNA/RNA测量仪（DNA/RNA Counter），Pharmacia公司产品；PCR扩增仪（Gene Amp PCR

31、 System 9600），PERKIN-ELMER公司产品；-70超低温冰箱，SANYO公司产品；CO2培养箱，SANYO公司产品；GIS凝胶成像系统，上海天能科技有限公司产品；荧光倒置显微镜，Olympus公司产品；倒置显微镜，Olympus公司产品；SORVALL ULTRA Pro80高速冷冻离心机，美国科峻(Kendro)仪器公司的产品；Universal 16R高速台式冷冻离心机(Sigma)；Himac CR21低温高速离心机 (HITACHI)；恒温摇床（武汉科学仪器厂）；高压电泳仪（北京六一仪器厂）；TZK-800Z型紫外可见分光光度计（秦州无线电仪器厂）；SMW3800微波

32、炉（Japan）；微量恒温器（上海蒲江分析仪器厂）； 酸度计(Beckerman)。1.4 各种溶液及培养液（1）10% SDS：SDS 50g，浓盐酸调pH 7.2，加蒸馏水定容至500 ml。 （2）1 mol/L Tris：Tris 121.1g，加蒸馏水定容至1000 ml。（3）0.5 mol/L EDTA：EDTA-Na2H2O 186.1g，加蒸馏水约800 ml，剧烈搅拌，加NaOH调pH 8.0，加蒸馏水定容至1000 ml，高压蒸汽灭菌。（4）TE（pH 8.0）：1 mol/L Tris 10 ml，0.5 mol/L EDTA 2 ml，调pH 8.0，加蒸馏水定容至1

33、000 ml，高压蒸汽灭菌。（5）50TAE：Tris 121.1g，冰醋酸 28.5 ml，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）50 ml，加蒸馏水定容至500 ml。（6）100 mmol/L CaCl2：CaCl26H2O 5.4g，加蒸馏水定容至200 ml，高压蒸汽灭菌。（7）溶液：葡萄糖0.9g，1 mol/L Tris-HC1 2.5 ml，0.5 mol/L EDTA 2 ml，调pH 8.0，加蒸馏水定容至100 ml，高压蒸汽灭菌15 min。（8）溶液：根据实验需要现用现配，取适量体积2 mol/L NaOH与10% SDS混合后进行10倍稀释，使其终浓度分别为0

34、.2 mol/L NaOH与1% SDS。（9）溶液：KAc 29.44g，冰醋酸11.5 ml，加蒸馏水定容至100 ml。（10）10 mg/ml RNase：无DNase的胰RNase溶于10 mmol/L TrisCl（pH 7.5）、15 mmol/L NaCl，配成10 mg/ml的浓度，100加热15 min，冷却至室温，分装成小份保存于-20。（11）LB培养基（pH 7.5）：Tryptone 1g，Yeast Extract 0.5g，NaCl 1g，调pH 7.0，加蒸馏水定容至100 ml，高压蒸汽灭菌20 min。制备平板时加入1.5g的琼脂粉。（12）5 mol/L

35、 LiCl：LiClH2O 30.2g，加蒸馏水定容至100 ml，高压蒸汽灭菌20 min。（13）碱性磷酸酶缓冲液：100 mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl2，100 mmol/L TrisCl pH 9.5。（14）MEM原液：称取MEM 1g溶于100 ml四馏水中，高压灭菌后备用。（15）MEM完全培养液：取MEM 原液100 ml，谷氨酰胺2 ml，蒽诺沙星4 ml，小牛血清5%，用3.5% NaHCO3调至培养液呈红色。（16）MEM维持液：除小牛血清为2%以外，其余成分与MEM完全培养液相同。（17）NBT/BCIP显色液：66 ml NBT溶液（0.5g NB

36、T溶于10 ml 70%二甲基甲酰胺溶液中）和10 ml碱性磷酸酶缓冲液（100 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，100 mmol/L TrisCl pH9.5）混匀，加入33 ml BCIP溶液（0.5g BCIP溶于10 ml 100%二甲基甲酰胺液中），此显色液应在30 min内使用。2 实验方法 2.1 基础实验操作方法2.1.1 感受态细胞的制备（1）DH5，JM109菌液（无质粒）用50%甘油保存于-70，取出解冻后，吸取200l菌液，在Amp-琼脂平板表面涂匀，37培养12h（过夜）。（2）用牙签挑取单个菌落，接种于3ml Amp- LB液体培养基中，37，

37、振荡培养过夜（250tpm）。（3）按1%接种到250ml（或100ml）预冷的Amp- LB培养液中，37，振荡培养到OD600=1.0（或0.30.4或0.40.6）左右，约12h即可。（4）冰浴30min（或10min），冷却至0。（5）5000r/min，4，离心10min，（250离心管，收集菌体）。（6）菌体悬浮于0.1体积的预冷CaCl-TrisHCl溶液中（注: 100mmol/L CaCl2，10mmol/L TrisHCl （pH6.5），冰浴15min。4，5000r/min离心515min。（7）弃上清，菌体重悬于2mL含15%甘油的Tris- CaCl2液中。（8）以

38、100l/Eppendorf管分装，-70保存。2.1.2 质粒的转化（1）取冻存的感受态菌一支（100l菌液，冰盒），冰浴10min（化开即可）。（2）取适量质粒（质粒1l，连接产物10l，DNA50ng），加入到100l200l感受态菌中，充分混匀（20:1），冰浴30 min （or 时间稍长）。（3）立即42水浴热冲击90s（勿动试管）。（4）立即冰浴10 min。（5）无菌条件下每管（1.5ml Eppendorf管）加5体积（8001000l）37预热的LB培养液（无Amp）。（6）37振荡培养4060 min（时间不宜过长，转速不宜过高，主要作用使细菌复苏）。（7）4000r/m

39、in离心1 min，倒掉大部分上清液，将其作为菌液（约50100l）涂于LB（Amp+）平板上（每1ml培养液加1L 50g/ml Amp，实际操作中加2体积的）Amp。（8）37培养过夜（1416h），获得透明、粟粒状单菌落。2.1.3 质粒的小量制备（1）用牙签挑取经实验一获得的单个菌落（含质粒），接种到25ml LB培养液中（试管）（每ml培养液加12l 50g/ml Amp），37振荡过夜（250r/min，1216h）。（2）分装至1.5mL Eppendorf管中（同时保存少量菌种供以后大提或扩菌用），4， 12000r/min， 离心1 min。（3）收集菌体，弃上清，倒置滤纸上

40、空干。（4）将菌体放于冰盒上，重悬于100l冰预冷的溶液中，剧烈振荡均匀（用震荡器），充分悬浮，不要有沉淀块，冰浴10min（也可直接下一步）。（5）加200l的新配制的溶液，盖紧轻轻倒转35次以混合内容物，不要强烈振荡，绝对混匀后呈半透明胶体状，冰浴35min（以完全澄清为度，不宜过久）。（6）加150L冰预冷的溶液，温和震荡10s后，冰浴515 min（可延长时间）。（7）4，1000012000 r/min， 离心10 min。（8）取上清，用等体积酚抽提，颠倒几次，混匀后4，12000r/min，离心810 min，取上清移至另一个Eppendorf管中。(此步可省略)（9）用等体积酚

41、：氯仿、异戊醇（25241）抽提，4，12000r/min离心810 min，取上清移至另一个Eppendorf管中。（10）用等体积酚氯仿异戊醇（25241）再次抽提，4，12000r/min，离心810 min，取上清移至另一个Eppendorf管中。（此步可省略）（11）用等体积氯仿、异戊醇（241）抽提，4，12000r/min离心10min，取上清移至另一个Eppendorf管中。（12）加0.1体积的3mol/L醋酸钠，用2体积的冷无水乙醇沉淀质粒DNA，-20放置2h或更长时间，4，12000r/min，离心1015 min。（有资料表明在-20沉淀会有较多盐析出，建议在室温放置

42、2min沉淀DNA）（13）弃上清，加入0.5ml 70%（4）乙醇振荡漂洗沉淀，彻底去上清，用消毒后的滤纸条小心吸净管壁上的乙醇水珠（残留后会对后续工作中使用的酶产生一定的影响），将管倒置放在滤纸上，室温下蒸发痕量乙醇1015min（实际操作中可置于37温箱中30min）。（14）加入2025lRTE（pH8.0）（含无DNA的RNA酶20g/ml的TE溶液），溶解DNA， 37水浴1h后可进行内切酶酶切实验或20贮存（对于目的质粒可用于再转化感受态）2.1.4 质粒的大量制备（1）用牙签挑取单个菌落接种于25ml（Amp+）LB培养基中，37振荡（220r/min）培养12h左右（或过夜）

43、。（此步应设无菌对照，同时可取少量作为菌种保存）（2）以1%接种于200ml高压LB培养液中，37振荡培养1218h，OD6002.0左右时（约12h），倒入250ml离心管中，置冰上10 min（此步亦可留取菌液作种用）。（3）7000r/min，4，离心15min。（4）弃上清，倒置于滤纸上空干。（5）放于冰盒中，重悬于5ml溶液（冰预冷），振荡悬浮，不要有沉淀块。（6）加溶液 10ml（5mL 2%SDS+5mL 0.4M NaOH）混匀57次，可以轻轻转动管，动作要慢、轻，使之粘稠、半透明胶体状，冰浴（或室温）5 min（可以缩短，切忌延长）。（7）加7.5ml溶液，上下颠倒混匀，同上

44、步操作，此步绝对避免强烈振荡。全部形成白色小块状，要彻底。冰浴15min，形成白色絮状沉淀，此时可见溶液清亮。（溶液=121.5）（8）4，7000 r/min，离心1015min。（9）将上清倒入50 ml离心管中，加0.7体积的（或等体积）异丙醇沉淀DNA，室温30min以上或4过夜。（10）900010000 r/min， 室温离心15min。（4离心将导致大部分盐析出混入沉淀），小心弃上清。（11）用冷的70%乙醇（12ml）漂洗1次，12000r/min离心25min，倒掉乙醇，室温干燥或真空抽干。（此步省略）（12）溶于1.5ml的TE（pH8.0）缓冲液中，放置室温，待沉淀周边溶

45、解以后，摇匀使之全部溶解。2.1.5 质粒的纯化（1）取1.5 ml溶于TE中的质粒DNA溶液（由质粒大量制备获得），加等体积的冰预冷的5mol/L LiCl（聚合作用，去杂质）混匀，冰浴15 min，4，10000 or 12000r/min，离心 15min。（2）取上清500l于Eppendorf 管，加等体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇，充分混匀，室温放置30min以上或冷冻过夜，4，10000 r/min，离心15min。（如果采用异丙醇沉淀，则室温放置30min，12000 r/min，离心1015min）（3）弃上清，用70%乙醇洗二次，干燥（可放置37温箱中干燥30 min左右

46、）。（4）用400l TE（pH8.0）溶解沉淀，加入40l 3mol/L NaAC，加2体积（或加满）的无水乙醇沉淀23h，或更长或过夜，用70%乙醇洗涤一次，室温干燥或真空抽干。（此步可省略）（5）加入500l的RTE缓冲液（含Rnase 20g/ml）（按200ml加200l）， 室温放置，待沉淀溶解后，37，水浴3h。（6）加入等体积的含13聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl，充分混匀，4 ，静置过夜，4，12000r/min，离心5min，去上清，用400ul TE（pH8.0）溶解沉淀。（此步可省略，但用于转染的大提质粒此步不能省略）（7）用等体积的饱和酚抽提

47、一次，酚：氯仿、异戊醇（25241）抽提第二次，氯仿、异戊醇（241）抽提第三次。每次混匀后，室温，12000r/min，离心10min（每次均取上清）（8）小心吸取上清，加入0.1体积的3mol/L NaAC，2无水乙醇（一般加满），此时可见白色沉淀， -20，23h 或过夜。（9）4，12000r/min，离心10 min。（10）弃上清，用500 ul，4 70%乙醇洗涤沉淀，稍振荡，4，12000r/min，离心2 min。（11）弃上清，室温干燥或真空抽干。（12）用50l TE（pH8.0）缓冲液 （或ddH2O，用于酶切）溶解沉淀，20保存备用。2.1.6 限制性内切酶酶切反应单

48、酶酶切反应 将2.0g的质粒DNA与适量水混匀，使其总体积为18l，加入23单位限制性内切酶及2l相应的10限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置最适反应温度水浴2h，取10l反应液进行琼脂糖凝胶电泳检查。对大量质粒DNA的酶切反应，相应扩大限制性内切酶的用量和反应体积。双酶酶切反应 选择两种酶反应活性均在75%100%的同一缓冲系统进行双酶切反应，若温度或缓冲系统不同，则按先低温后高温，先低盐后高盐的顺序进行。将2.0g的质粒DNA与适量水混匀，使其总体积为20l，加入23单位限制性内切酶及2l相应的10限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置最适反应温度水浴2h，取10l反应

49、液进行琼脂糖凝胶电泳检查。2.1.7 琼脂糖凝胶电泳 用1TAE或0.5TBE琼脂糖凝胶电泳缓冲液按质量（g）体用1TAE或0.5TBE琼脂糖凝胶电泳缓冲液按质量（g）体积（ml）比（m/v）配制所需浓度的琼脂糖凝胶溶液，加热使琼脂糖完全溶解，冷却至60左右加入适量的溴化乙锭至终浓度约为0.5g/ml，充分混匀后缓慢倒入根据需要选定的电泳胶模中，厚度在35 mm之间，插入相应的梳子，待凝胶完全冷却凝固后，将凝胶放入装有与配制琼脂糖凝胶溶液类型相同缓冲液的电泳槽中，加入刚好没过凝胶面的电泳缓冲液，小心拨出梳子。取适量待进行电泳检测的DNA样品滴加在Parafilm膜上，与合适体积的10DNA上样

50、缓冲液混匀后，用微量加样器小心的将混合后样品加到点样孔中，此时凝胶已浸没在缓冲液中。以15 V/cm的电压进行电泳，DNA应向阳极（红色）移动。当溴酚蓝指示剂迁移至凝胶适当位置后，停止电泳。在紫外灯下观察记录结果，并拍照保存。2.1.8 质粒DNA的定量以TE（pH 8.0）为空白对照，用TZK-800Z型紫外分光光度计测定波长260nm和280nm的核酸溶液光密度（OD）值。OD260=1相当于含质粒大约50g/ml，双链DNA纯品的OD260/OD280值为1.8，若OD260/OD280值明显低于1.8，则可能有蛋白质或酚污染，需进一步纯化。若OD260/OD280值明显高于1.8，则可

51、能有RNA，需进一步用RTE消化。2.1.9 目的基因回收采用北京鼎国生物技术公司的DNA凝胶回收试剂盒回收目的片断，方法如下：电泳结束后，用洁净的刀片在长波紫外灯下切下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶，放入1.5 ml新离心管中。将切取的含DNA片段的凝胶捣碎，按重量（mg）体积（l）比1:3（DNA片段：溶液B）加入溶液B。56水浴10 min，直至胶完全融化，其间漩涡振荡三次，琼脂糖必须完全融化。如果体积大于500l，可适当增加溶胶时间，若此时溶液变红，可加15l溶液E。将溶液置于离心柱中，静止12 min，5000 r/min离心3060s。若一次加不完，可分两次离心。倒掉液体，加入50

52、0l溶液C于离心柱中，8000 r/min离心3060s，倒掉液体。以500l溶液C再洗一遍，8000 r/min离心3060s。12000 r/min再次离心3060s，甩干剩余液体。将离心柱置于新离心管中，加入3050l预热溶液D，混匀，静止2 min，12000 r/min离心60s。管底即为回收目的片段。2. 1.10 外源DNA片段与质粒载体的连接反应取约1l回收的载体DNA，加入35倍的外源DNA片段、10连接缓冲液1l，混匀后加入T4DNA连接酶0.5l，最后加水至总体积10l，16水浴过夜。2.2 重组质粒pIRES-gp41的构建2.2.1 目的基因gp41的扩增 用于扩增g

53、p41全基因的引物采用DNASIS核酸分析软件用微机自行设计，并由上海生物工程公司合成。 p1 ：上游引物(引入EcoR I酶切位点)： 5-CGGAATTCATGAAGAGAAGAGTGGTGCAGAG-3 p2 ：下游引物(引入EcoR I酶切位点)： 5-CGGAATTCCACTACTTTTTGACCACTTG-3以携带有HIV-1 NL-43 Env基因的质粒pJen10为模板，PCR扩赠gp41全基因。然后EcoR I酶切连入pHIL-S1质粒。PCR反应条件：95预变性260s，(加入Taq酶，瞬间离心)94 60s，55 60s，72 120s，共30个循环，最后72延伸10mi

54、n。2.1.2重组质粒pIRES-gp41的构建将gp41-pHIL-S1用EcoR I酶切下gp41基因，用T4DNA连接酶连接到真核表达载体pIRES，连接体系见表1，16连接过夜，构建重组质粒pIRES-gp41，将连接物转化大肠杆菌DH5a。表1 连接体系的组成Tab.1 system of ligation连接体系的成分组分的体积（l）10 连接buffer1目的片段（gp41）3pIRES载体1T4DNA 连接酶0.5ddH2O4.5总体积10 挑取单个转化菌落，在LB平板上挑取单个菌落，提取质粒后酶切鉴定阳性克隆。然后进行质粒的大量提取与纯化（见基础操作部分），使之达到一定浓度，

55、 用来免疫实验动物。2.3 重组质粒转染哺乳动物细胞2.3.1 细胞计数取细胞悬液0.5ml，加入台盼兰溶液0.5 ml，置室温或37温箱中510 min，充分振荡后，用毛细管吸取，滴入血细胞计数板内，按白细胞计数法计数四角大方格内的细胞总数N。计数时仅计数细胞核与胞浆完整的细胞。将4角大方格内的细胞总数按公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数n=N/410000K( K为稀释倍数)。2.3.2 细胞培养根据细胞计数结果，用营养液（0.5%乳白蛋白水解物97ml、犊牛血清2ml、抗生素1ml，以碳酸氢钠溶液调整pH为7.27.4）稀释为每毫升5105个细胞即可装瓶培养。每25ml容量小瓶装4ml，

56、置37孵箱内培养。细胞在12h贴壁，2448h长成单层。2.3.3 脂质体转染于630mm的培养板中接种传代的BHK-21细胞 11053105个/ml，当细胞长至60%80% 单层时，将培养液弃掉，用无Ca2+、Mg2+ PBS洗涤细胞两遍，备用。与在室温下作用1530min的转染试剂和重组质粒的混合物共转染。即在500l MEM中，加入10l Liposome，轻轻混匀，将重组质粒DNA 10g加入到另取的500l MEM中，混匀；然后将后者滴加于前一液体中，吹气混匀，温室作用1530min。转染后56h，更换新鲜配制0.5g的MEM培养液，继续培养48h，荧光显微镜下观察结果并照相保存。

57、2.3.4 重组质粒基因表达产物的检测（间接免疫荧光法，IFA）在630mm培养板中放入盖玻片，传代培养BHK-21细胞。次日，在500l无血清MEM中加入10g欲转染的质粒pIRES-gp41，混匀。另取500l无血清MEM，加入10l转染试剂（Lipofectin Reagent），混匀。将含有质粒的500l MEM逐滴加入含有转染试剂的500l MEM中，轻轻混匀，室温静置30min。将长成40%60% 单层BHK-21细胞的培养液MEM吸出，用无血清MEM洗两次，加入1ml含有脂质体包裹质粒的MEM，于37C、5% CO2 感作45h后补加2ml含5%小牛血清MEM，继续培养48h。以

58、上操作均需在无菌条件下进行。取出盖玻片，PBS（pH7.2）漂洗一次，冷丙酮固定1015 min。PBS洗涤3次，与HIV-1阳性血清（1:300）反应1.5h，PBS洗涤3次，然后与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗人IgG反应2h。PBS洗涤3次，在载玻片上滴一滴甘油缓冲液（50%甘油PBS），将载有细胞的盖玻片置于载玻片上，于荧光显微镜下，波长495nm处观察并拍照保存。2.3.5 核酸疫苗免疫小鼠BALB/c雌性小鼠20只。68周龄,体重1820g,属于SPF级动物,以上实验动物均具有合格证书,随机分为两组,分别注射空白质粒pIRES对照组和pIRES-gp41免疫组。每只小鼠于双侧

59、径前肌直接注射总容量为100l的PBS质粒溶液。共免疫三次。最后一次免疫后第八天摘眼球取血，凝血分离血清供ELTSA检测抗HIV抗原的IgG抗体。无菌取其脾脏检测T淋巴亚群的数量。2.3.6 脾脏单淋巴细胞悬液制备无菌条件下取出小鼠脾脏，置于盛有4ml Hanks液的平皿中，用玻片研磨，200目尼龙网过滤制成单细胞悬液，3000r/min离心10min，弃上清。将沉淀重悬于4ml红细胞裂解液中，室温静止10min，离心后再用Hanks液重悬细胞，洗细胞，重悬于含有10%NBS的RPMI1640培养液中，计数，调整细胞数至2107个/ml，备用。2.3.7 CD4+ CD8+T淋巴细胞计数取脾单细胞悬液100ul，吹打20s，加5mlPBS，1500r/min，离心10min，弃上清，洗细胞两次，在0.5ml细胞悬液中分别加荧光标记大鼠抗小鼠CD4+、CD8+单克隆抗体20ul，混匀后室温避光放置30min，再加5mlPBS洗一次，1500r/min离心10min，将管底细胞用200ulPBS悬浮，200目尼龙网过滤后上流式细胞仪检测，FACS检测10000个细胞，所得数据以XSD表示，并进行统计学分析。荧光洗液: 0.15mol/L PBS，2% NBS，0