微生物的分离与培养技术原理及其应用

1、 一、培养基的营养构成与类型划分一、培养基的营养构成与类型划分 营养构成营养构成划分依据划分依据培养基培养基 种类种类 制备方法制备方法用途用途 物理物理 性质性质 加凝固剂如：加凝固剂如： 半固体半固体 培养基培养基 观察微生物运观察微生物运 动动 液体液体 培养基培养基 不加凝固剂不加凝固剂 工业生产工业生产 化学化学 成分成分 天然天然 培养基培养基 成分不明确的成分不明确的 天然物质天然物质 工业生产工业生产 成分明确已知成分明确已知 分离、纯化、分离、纯化、 鉴定、计数鉴定、计数 用途用途 功能功能 加入某种化学加入某种化学 物质物质 加入某种指示加入某种指示 试剂试剂 水、无机水、

2、无机 盐、碳源盐、碳源 和氮源和氮源 还要满足还要满足特特 殊营养物质殊营养物质 （生长因（生长因 子）、氧气子）、氧气 以及以及温度、温度、 PH要求。要求。 固体培养基固体培养基 琼脂琼脂 分离、纯化、分离、纯化、 鉴定、计数鉴定、计数 合成培养基合成培养基 选择培养基选择培养基 鉴别培养基鉴别培养基 分离筛选特定分离筛选特定 微生物微生物 鉴别不同微生鉴别不同微生 物物 需分离需分离 微生物微生物 选择培选择培 养基养基 鉴别培养鉴别培养 基基 鉴定原理鉴定原理 尿素尿素 分解菌分解菌 纤维素纤维素 分解菌分解菌 大肠大肠 杆菌杆菌 一般一般 培养培养 基基 伊红美伊红美 蓝培养蓝培养

3、基基 大肠杆菌菌落呈现黑色大肠杆菌菌落呈现黑色,， 带有金属光泽带有金属光泽 尿素作尿素作 为唯一为唯一 氮源氮源 酚红指酚红指 示剂示剂 细菌合成的细菌合成的脲酶脲酶将将尿素尿素分分 解生成解生成氨氨。使培养基的。使培养基的碱碱 性增强，性增强，pH升高，升高，指示剂指示剂 变红变红 纤维素纤维素 作为唯作为唯 一一碳源碳源 刚果红刚果红 染色法染色法 四种纤维素分解菌四种纤维素分解菌 在刚果红培养基上在刚果红培养基上 形成的透明圈形成的透明圈 大肠杆菌在伊红美蓝琼大肠杆菌在伊红美蓝琼 脂培养基上的黑色带金脂培养基上的黑色带金 属光泽的菌落属光泽的菌落 二、二、 操作技术操作技术 微生物分离

4、培养成功微生物分离培养成功关键关键（消毒与灭菌）（消毒与灭菌） 1、实验操作者双手：、实验操作者双手： 2、接种环、接种针或试管口、瓶口：、接种环、接种针或试管口、瓶口： 3、锥形瓶、培养皿：、锥形瓶、培养皿： 4、培养基：、培养基： ( (不能采用干热灭菌不能采用干热灭菌) ) 无菌无菌 70% 70%酒精消毒酒精消毒 灼烧灭菌灼烧灭菌 干热灭菌和高压蒸干热灭菌和高压蒸 汽灭菌（湿热灭菌）汽灭菌（湿热灭菌） 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 【例题例题1 1】为了获得为了获得-胡萝卜素胡萝卜素产品产品,某小组开某小组开 展了产展了产-胡萝卜素酵母的筛选与色素提取胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。实验

5、。 请回答下列问题：请回答下列问题： （1）实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是）实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是 ；为了防止冷凝水渗入；为了防止冷凝水渗入 及减少灭菌后器皿或培养基被污染，灭菌前应及减少灭菌后器皿或培养基被污染，灭菌前应 该该 。 (2)为了筛选出酵母菌为了筛选出酵母菌,培养基中添加了青霉素培养基中添加了青霉素 ，其目的是，其目的是 。 干热灭菌和高压蒸干热灭菌和高压蒸 汽灭菌（湿热灭菌）汽灭菌（湿热灭菌） 牛皮纸或几层报纸包扎紧牛皮纸或几层报纸包扎紧 抑制细菌生长抑制细菌生长 高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅 压力表压力表 安全阀安全阀放气阀放气阀 灭菌桶灭菌桶 排气软管排气软

6、管 【例题例题1 1】为了获得为了获得-胡萝卜素胡萝卜素产品产品,某小组开某小组开 展了产展了产-胡萝卜素酵母的筛选与色素提取胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。实验。 请回答下列问题：请回答下列问题： (3) (3)右图是灭菌锅及其局部剖面示意图，图右图是灭菌锅及其局部剖面示意图，图 中甲、乙、丙依次是中甲、乙、丙依次是 。(填序号填序号) 安全阀、放气阀、压力表安全阀、放气阀、压力表 放气阀、安全阀、压力表放气阀、安全阀、压力表 安全阀、放气阀、温度表安全阀、放气阀、温度表 放气阀、安全阀、温度放气阀、安全阀、温度 【例题例题1 1】为了获得为了获得-胡萝卜素胡萝卜素产品产品,某小组开某小组

7、开 展了产展了产-胡萝卜素酵母的筛选与色素提取胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。实验。 请回答下列问题：请回答下列问题： （4）为了将分离到菌株纯化）为了将分离到菌株纯化,挑取菌落挑取菌落在在3块块 相同平板上划线相同平板上划线,结果其中一块平板各划线区结果其中一块平板各划线区 均未见菌生长，最可能原因是均未见菌生长，最可能原因是 。 （5）为增加）为增加-胡萝卜素提取量，在研磨酵母胡萝卜素提取量，在研磨酵母 细胞时，添加石英砂的目的是细胞时，添加石英砂的目的是 ；研；研 磨时磨时 (填填“需要需要”或或“不需要不需要”) 添加添加CaCO3，理由是，理由是 。 接种环温度过高，接种环温度过高

8、， 菌被杀死菌被杀死 研磨充分研磨充分 不需要不需要 -胡萝卜素较耐酸胡萝卜素较耐酸 （较稳定）（较稳定） 计算计算 大肠杆菌的分离纯化培养大肠杆菌的分离纯化培养 （一）制备（一）制备牛肉膏蛋白胨固体牛肉膏蛋白胨固体培养基培养基 称量称量 溶化溶化( (调节调节PH)PH) 灭菌灭菌 倒平板（倒平板（5050） 倒平板（倒平板（5050） 防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染； 使培养基表面的水分更好地挥发使培养基表面的水分更好地挥发 平板倒置平板倒置 平板冷凝平板冷凝 打开一条缝隙打开一条缝隙 倒平板（倒平板（5050） 大肠杆菌的分离纯化培养大肠杆菌的

9、分离纯化培养 （二）（二）分离纯化分离纯化大肠杆菌大肠杆菌 方法一、平板划线法方法一、平板划线法 方法一、平板划线法方法一、平板划线法 单菌落单菌落 丙丙 甲甲 乙乙 （一）系列稀释（一）系列稀释操作操作 101102103104 105106 移液管移液管 移液管移液管吸取菌液稀释时吸取菌液稀释时，轻压橡皮头，轻压橡皮头，吹吸三次吹吸三次 的目的是？的目的是？ 使菌液与水充分混匀使菌液与水充分混匀 方法二、稀释涂布平板法方法二、稀释涂布平板法 （二）涂布平板（二）涂布平板操作操作 【例题例题2】 微生物的分离和培养是现代生物微生物的分离和培养是现代生物 工程应用中的重要环节。据此回答：工程应

10、用中的重要环节。据此回答： （1）甲操作称为）甲操作称为 ，指出乙、丙操作的，指出乙、丙操作的 错误：乙错误：乙 ， 丙丙 。 （2）判断：固体培养基上由一个细胞繁殖而）判断：固体培养基上由一个细胞繁殖而 来的肉眼可见的子细胞群体叫做来的肉眼可见的子细胞群体叫做 ，属于，属于 生命系统的生命系统的 层次。层次。 倒平板倒平板 未在酒精灯火焰附近（旁）划线未在酒精灯火焰附近（旁）划线 最后一区域划线与第一区域相连最后一区域划线与第一区域相连 菌落菌落 种群种群 （3 3）判断：）判断： 不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个 的菌落（的菌落（ ） 打开含菌种

11、的试管需通过火焰灭菌（打开含菌种的试管需通过火焰灭菌（ ） 溶化时将称好的牛肉膏从称量纸上直接倒入溶化时将称好的牛肉膏从称量纸上直接倒入 烧杯（烧杯（ ） 熔化琼脂时，需要用玻璃棒不断搅拌以防止熔化琼脂时，需要用玻璃棒不断搅拌以防止 糊底（糊底（ ） （4 4）分散细菌得到单菌落）分散细菌得到单菌落 法法 比比 法效果更好。法效果更好。 稀释度足够高的稀释度足够高的 口口 连同称量纸一同连同称量纸一同 稀释涂布平板法稀释涂布平板法 平板划线法平板划线法 平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法 研究者得到一个经培养后菌落分布如图研究者得到一个经培养后菌落分布如图 所示的平板，推测接种时

12、可能的操作失所示的平板，推测接种时可能的操作失 误？误？ 涂布不均匀涂布不均匀 （5）每次划线前和划线后，接种环都要通过）每次划线前和划线后，接种环都要通过 灼烧灭菌，完成右图丙的划线操作，灼烧灭菌，完成右图丙的划线操作， 共需灼烧接种环共需灼烧接种环_次。灼烧接种环之次。灼烧接种环之 后，要冷却后再进行划线操作的原因后，要冷却后再进行划线操作的原因 是是 。 （6）第二次以及其后的划线操作时，总是从）第二次以及其后的划线操作时，总是从 上一次划线的末端开始划线，原因是上一次划线的末端开始划线，原因是 _，多次划线的目的，多次划线的目的 是是 。 6 以免接种环温度过高，杀死菌种以免接种环温度

13、过高，杀死菌种 末端细菌数目比起始端少末端细菌数目比起始端少 使细菌数目随划线次数增加逐渐减少，使细菌数目随划线次数增加逐渐减少， 以便分离得到单菌落以便分离得到单菌落 （7 7）右图是某同学修正丙操作后的正确的）右图是某同学修正丙操作后的正确的“微生物平微生物平 板划线板划线”示意图。示意图。划线顺序为划线顺序为1234512345。下列有下列有 关叙述中正确的是（关叙述中正确的是（ ） D 大肠杆菌的分离纯化培养大肠杆菌的分离纯化培养 （三）分离纯化后（三）分离纯化后培养培养 未接种培养基未接种培养基 接种培养基接种培养基 无菌落产生无菌落产生 有菌落产生有菌落产生 1、对照培养方法：将、

14、对照培养方法：将 。 2、对照培养结果：、对照培养结果： 若未接种培养基上若未接种培养基上 ， 接种培养基上接种培养基上 ， 则说明符合要求。则说明符合要求。 （三）分离纯化后（三）分离纯化后培养培养 未接种培养基和已接种培养基都放入适未接种培养基和已接种培养基都放入适 宜温度恒温箱中培养适宜时间观察结果宜温度恒温箱中培养适宜时间观察结果 无菌落产生无菌落产生 有菌落产生，且菌落颜色、有菌落产生，且菌落颜色、 形状、大小基本一致并符合形状、大小基本一致并符合 大肠杆菌菌落特点大肠杆菌菌落特点 土壤土壤“纤维素分解菌纤维素分解菌”的分离与筛的分离与筛 选选 土壤土壤“尿素分解菌尿素分解菌”的分离

15、与计数的分离与计数 稀释涂布平板法稀释涂布平板法 【实验设计实验设计】 土壤取样土壤取样选择培养选择培养* 样品稀释样品稀释 （梯度稀释）（梯度稀释） 将样品涂布到将样品涂布到鉴别纤维鉴别纤维 素分解菌的培养基素分解菌的培养基上上 挑选产生挑选产生透明透明 圈圈的菌落的菌落 什么样的环什么样的环 境取样境取样? 选择培养的目的选择培养的目的? ? 液体培养基液体培养基 （2 2）分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误）分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误 的是（的是（ ） A.A.经经选择培养选择培养 后后将样品涂布在鉴别纤维素分将样品涂布在鉴别纤维素分 解菌的培养基上解菌的培养基上 B.B.选

16、培养这一步可省略，但培养的纤维素分解选培养这一步可省略，但培养的纤维素分解 菌少菌少 C.C.经稀释涂布培养后，用刚果红染色经稀释涂布培养后，用刚果红染色 D.D.对照组对照组可用同样量的培养液涂布到可用同样量的培养液涂布到不含纤维不含纤维 素的培养基上素的培养基上 样品稀释（梯度稀释）样品稀释（梯度稀释） A 【实验设计实验设计】 土壤取样土壤取样选择培养选择培养* 样品稀释样品稀释 （梯度稀释）（梯度稀释） 将样品涂布在将样品涂布在选择尿素选择尿素 分解菌的培养基分解菌的培养基上上 统计菌落数统计菌落数 计数细菌数计数细菌数 什么样的环什么样的环 境取样境取样? 选择培养的目的选择培养的目

17、的? ? 液体培养基液体培养基 观察菌落观察菌落 同种微生物菌落特征：同种微生物菌落特征：颜色、形状、大小、颜色、形状、大小、 隆起程度（突起）、边缘隆起程度（突起）、边缘等方面基本一致，等方面基本一致， 这些都是区分细菌的重要手段。这些都是区分细菌的重要手段。 土壤土壤“尿素分解菌尿素分解菌”的分离与计数的分离与计数 【样品稀释样品稀释】 【平板涂布平板涂布】 【统计菌落统计菌落】 【计数菌数计数菌数】 90mL无菌水无菌水 9mL无菌水无菌水 9mL无菌水无菌水 【样品稀释样品稀释】 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数， 在对应在对应稀释

18、倍数为稀释倍数为10106的培养基中，几位同学分别得的培养基中，几位同学分别得 到以下几种统计结果：到以下几种统计结果： A A同学：同学：涂布了一个平板，统计的菌落数是涂布了一个平板，统计的菌落数是230230 B B同学：同学：涂布了两个平板，统计的菌落数是涂布了两个平板，统计的菌落数是215215和和260260 ，取平均值，取平均值238238 C C同学：同学：涂布了三个平板，统计的菌落数分别是涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2121、 212212和和256256，取平均值，取平均值163163 D D同学：同学：涂布了三个平板，统计的菌落数分别是涂布了三个平板，统计的菌落数分别

19、是210210、 240240和和480480，取平均值，取平均值310310 E同学：同学：涂布了三个平板，统计的菌落数分别是涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210210、 240240和和250250，取平均值，取平均值233233 90mL无菌水无菌水 9mL无菌水无菌水 9mL无菌水无菌水 0.1mL 0.1mL 0.1mL 至少涂布至少涂布3个平板；个平板；菌落数目在菌落数目在30-300个之个之 间的平板最适宜计数间的平板最适宜计数 【平板涂布与菌落统计平板涂布与菌落统计】 设置对照实验设置对照实验 判断选择培养基中是否有杂菌污染：判断选择培养基中是否有杂菌污染： 未接种培养基（

20、对照组）与接种培养基同时进行培养未接种培养基（对照组）与接种培养基同时进行培养， 若若对照组对照组无菌落生长，说明培养基未被杂菌污染。无菌落生长，说明培养基未被杂菌污染。 判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用： 牛肉膏蛋白胨培养基（对照组）与尿素选择培养基牛肉膏蛋白胨培养基（对照组）与尿素选择培养基都接种后同时培都接种后同时培 养养，观察两种培养基上菌落数目，若对照组培养基菌落数目，观察两种培养基上菌落数目，若对照组培养基菌落数目明显大明显大 于于选择培养基（实验组）的数目，说明起到了筛选、选择作用。选择培养基（实验组）的数目，说明起到了筛选、选择作用。 不加尿素的培

21、养基（对照组）与尿素选择培养基不加尿素的培养基（对照组）与尿素选择培养基都接种后同时培养都接种后同时培养， 对照组培养基细菌不生长，菌落数目对照组培养基细菌不生长，菌落数目明显少于明显少于选择培养基（实验组）选择培养基（实验组） 的数目，说明起到了筛选、选择作用。的数目，说明起到了筛选、选择作用。 90mL无菌水无菌水 9mL无菌水无菌水 9mL无菌水无菌水 0.1mL 0.1mL 0.1mL 240个个 如何根据平板上统计的平均菌落数推测计数如何根据平板上统计的平均菌落数推测计数 出原来每克样品中的活菌数（菌株数）？出原来每克样品中的活菌数（菌株数）？ 每克样品中每克样品中 菌株数菌株数 某

22、一稀释度下的某一稀释度下的 平均菌落数（平均菌落数（C） 涂布平板时所涂布平板时所 用的稀释液体用的稀释液体 积积 mL （V） 稀释倍数稀释倍数 （M） 高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅 压力表压力表 安全阀安全阀放气阀放气阀 灭菌桶灭菌桶 排气软管排气软管 【例题例题2】 微生物的分离和培养是现代生物微生物的分离和培养是现代生物 工程应用中的重要环节。据此回答：工程应用中的重要环节。据此回答： （1）甲操作称为）甲操作称为 ，指出乙、丙操作的，指出乙、丙操作的 错误：乙错误：乙 ， 丙丙 。 （2）判断：固体培养基上由一个细胞繁殖而）判断：固体培养基上由一个细胞繁殖而 来的肉眼可见的子细胞群体

23、叫做来的肉眼可见的子细胞群体叫做 ，属于，属于 生命系统的生命系统的 层次。层次。 倒平板倒平板 未在酒精灯火焰附近（旁）划线未在酒精灯火焰附近（旁）划线 最后一区域划线与第一区域相连最后一区域划线与第一区域相连 菌落菌落 种群种群 1、对照培养方法：将、对照培养方法：将 。 2、对照培养结果：、对照培养结果： 若未接种培养基上若未接种培养基上 ， 接种培养基上接种培养基上 ， 则说明符合要求。则说明符合要求。 （三）分离纯化后（三）分离纯化后培养培养 未接种培养基和已接种培养基都放入适未接种培养基和已接种培养基都放入适 宜温度恒温箱中培养适宜时间观察结果宜温度恒温箱中培养适宜时间观察结果 无菌落产生无菌落产生 有菌落产生，且菌落颜色、有菌落产生，且菌落颜色、 形状、大小基本一致并符合形状、大小基本一致并符合 大肠杆菌菌落特点大肠杆菌菌落特点 （2 2）分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误）分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误 的是（的是（ ） A.A.经经选择培养选择培养 后后将样品涂布在鉴别纤维素分将样品涂布