薄层色谱实验

1、薄层色谱（TCL实验、实验目的1、掌握薄层色谱操作技巧2、了解薄层色谱的基本原理和应用二、实验原理1、原理薄层色谱是一种微量分析的分离过程， 它将样品点在以玻璃 板或铝、 塑料等片材为载体的多孔吸附剂薄层的固定相上， 利用 流动相在特定的展开室中将混合物中的组份推移到不同距离处， 在色谱展开整个过程中，样品的成份受到正反不同的力的作用。（1） 流动相利用毛细管力带着样品穿过固定相。（2） 样品与固定相的相互作用是指组份在移行过程中由于偶 极-（诱导） - 偶极相互作用，氢键和范德华力的作用而产生不同 程度的延缓、吸附、分散、离子交换和络合等分离机理。由于样品组份与流动相和固定相之间的相互作用力

2、程度不 同，整个毛细管流动过程中分离运动都在进行。基于这点， TLC 系统（流动相和固定相）必须与样品很好地匹配。用显色试剂处理， 许多组份可在日光或紫外灯光下检视。 色 谱可用肉眼或使用光密度计和照相机记录或影像系统方法来评 价。2、薄层色谱的用途1）化合物的定性检验通过与已知标准物对比的方法进行未知物的鉴定。在条件一致的情况下，纯化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距离，称比移值（R值）。利用薄层色谱法可鉴定化合物的纯度或确定两种 性质相似化合物是否为同一种物质。影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小， 酸碱度、活性、外界温度和展开剂纯度、组成、挥发度等。所以 要获得比移值重现性

3、就比较困难。为此，在测定某一式样时，最 好用对照品和样品同时对照进行。 -1d2di：2中心2）快速分离少量物质（几到几十 ug，甚至）3）跟踪反应进程，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观 察原料斑点的逐步消失，来判断反应是否完成。4）化合物纯度的检验（只出现一个斑点，且无脱尾现象， 为纯物质）3、主要操作步骤薄层板的制备；薄层板的活化；薄层板色谱展开；薄层色谱 显色与分析。四、薄层色谱操作技巧1、手工自制板玻璃板的要求： 用于制备薄层板的玻璃板要求 表面光洁、 平 整，最好使用厚薄12mm勺优质平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜 用于制作薄层板， 玻璃板 需洗净至不挂水， 晾干，贮存于干燥洁 净处

4、备用 。玻璃板反复使用时，应注意经常用洗液及碱液清洗， 保持玻璃板面勺光洁是保证薄层板质量勺最基本要求。制作方法：除另有规定外，将 1 份吸附剂加适量勺水（如 1 份硅胶G一般加3份水），在研钵中用研杵 沿一个方向小心研磨 至成均匀勺有适当粘稠度勺胶浆 ，立即倾入涂布器中， 均匀地向 前推进涂布在玻璃板上， 或按照不同涂布器勺规定操作涂布， 涂 布好勺薄层板于室温下在水平台上晾干，再在规定勺温度 （ 一般 为105C110C）下活化约30分钟，贮于干燥器中备用。薄层板 勺厚度一般为 0.5mm.。商品化供应勺预制板和高效板板的尺寸一般有 20x 20cm, 10 x 20cm 20x 10cm

5、, 10X 10cm2、TLC/HPTLC板的预洗及活化一般来说 色谱板应用溶剂如氯仿 - 甲醇（8:2） 甚至用更强 的洗脱溶剂的混合物进行预洗。 具体操作可通过空白色谱展开来 实现。色谱板预洗完后，应在105 C加热1小时进行干燥，再在 室温下置放至少 2 小时（需采取保护措施以防止实验室空气中的污染物重新附着在其上面，如放置在空的干燥器中）3、样品点样点状点样和条带状点样每次点样前，TLC/HPTLC板应在正常光线下和紫外灯下用肉 眼检查薄层的损伤情况和杂质，只有无损伤、清洁的 TLC/HPTLC 板方可使用。样品可进行点状或条带状点样。要想获得最佳的薄层分辨率，必须保证移行方向中的起点

6、要小，常规的TLC薄层点状点样每次点至 5 微升。点样量较大的样品可使用自动化装置点样， 喷 雾成条带状是一种可以点样量大而同时又能促成最有效分离的 点样方法。在常规操作过程中，人工点样一般使用 微量毛细管（0.5/1/2/3 和5卩I ）,点样时毛细管必须完全充满和完全排空， 要以垂直方向小心接触TLC/HPTLC板面，不要损伤薄层，受损的 薄层会导致溶剂不规律地流动而在色谱上产生失真的TLC谱带。样品点样位置起点下缘的最小距离 b 取决于溶剂量。 两个起点之间的距离 c 必须令平行移行的主成份不会相互触及。点状点样时原点的直 径应小于或等于3m（高效板原点的直径应更小），条带的长度d 由点

7、样样品体积或样品的种类和相对于板的尺寸点样的数目来 决定。到板侧边的距离 a 必须足够大以避免分离区失真变形。4、层析展开室4.1.1 直立式双槽展开室具有节省溶剂、便于预平衡、可控 制展开箱内的湿度等优点。4.1.2 水平展开室可以从薄层板的两侧向中间水平地展开， 这样可使一块薄层板所承受的样品个数比常规上行展开的薄层 板增加一倍。4.1.3自动展开室（AMD）可使用五种溶剂对同一薄层进行多 次展开，自动控制预饱和、展开方式、展开距离和干燥条件，分 离效率比传统方式提高三倍（可在80mm之内分离40种成分），符合GLP/GM要求。溶剂使用的溶剂必须是“分析纯”或“色谱纯” ，溶剂组成采用 体

8、积量比（如正丁醇/冰乙酸/水=4 ： 1 ： 1，V/V/V），或者绝对量 （女口 18ml甲苯+2ml甲醇）。其总量应足以使 TLC/HPTLC板的浸 入深度约为5mm展开剂要求新鲜配制，不要多次反复使用，如 需分层，则按要求放置分层后取需要的一相（上层或下层） ，备 用。五、本实验操作内容山楂有效组分熊果酸含量的鉴定。吸附剂 / 快板：硅胶 G3g， %羧甲基纤维素钠。供试品：取山楂，加乙酸乙酯 2ml，浸泽24h，取上清液备对照品：加甲醇制备成1ml含有1mg的溶液点样：供试品溶液点样 4ul ，对照品溶液点样 2ul展开剂：甲苯 / 乙酸乙酯 / 甲酸（ 20： 4：）。 显色剂：硫酸乙醇溶液（ 310%）显色操作：喷显色剂后，在 80 C加热数分钟，至斑点显色清晰为止，置日光或紫外灯（365nm下检测。六、实验注意事项1、载玻板干净且不被手污染，吸附剂在玻板上分布均匀平 整；2、 点样不能戳破薄层面板，各样点间距11.5cm，点样直 径应不超过 2mm。3、展开时，不让