复杂疾病研究思路PPT学习课件

1、高通量测序高通量测序 复杂疾病研究思路复杂疾病研究思路 2015年2月 复杂疾病：是在众多因素共同作用下发生的，如多个基因、一个基因的多个突变、环境作用以及未知的随 机因素，遗传模式复杂。可以认为对于复杂疾病来说，每个基因影响有限，单独不足以致病，而且可能对 于疾病既非充分也非必要。复杂疾病在普通人群中发病率较高（一般不少于1%），所以也叫“常见疾病”， 如精神分裂症、双相情感障碍、糖尿病、癌症等。 复杂疾病复杂疾病 心脑血管疾病（高血压、冠心病、卒中） 神经系统疾病（自闭症、帕金森、阿尔兹海默症） 代谢类疾病（糖尿病、甲亢） 呼吸系统疾病（慢阻肺） 自身免疫病（红斑狼疮、类风湿） 涉及疾病种

2、类涉及疾病种类 致病因素致病因素 遗传因素 基因变异 表观遗传 环境因素 生物性因素 理化性因素 营养性因素 精神性因素 研究方向研究方向 遗传易感性 发生发展机制 分子标志物 疾病治疗 遗传易感性遗传易感性 遗传基础是由多基因构成的，它部分决定了个体发病的风险。这种由遗传基础决定一个个体患病的风险称为 易感性。（因此学术界将遗传因素和环境因素共同作用决定个体患病某种遗传病的风险称为易患性。易感性 +环境因素=易患性） 遗传易感性遗传易感性 全基因组关联分析（Genome-wide association study，GWAS）是一种对全基因组范围内的遗传变 异基因总体关联分析的方法，能够一次

3、性对疾病进行轮廓性概览，适用于复杂疾病的研究。传统的 GWAS研究以芯片技术为主，依赖于已知基因序列和杂交反应，往往遗漏重要信息，且可靠性、重 复性差。近两年，利用高通量测序进行GWAS逐渐兴起。 SNP A 不患病SNP A 患病 SNP B 不患病SNPB 患病 统计分析 评价该SNP与该病 是否有关联及关联 程度 GWAS 患病人群正常人群 遗传易感性研究遗传易感性研究 常见常见变异假说变异假说 Common disease-Common variants: 常见疾病主要是由常见基因的常见变 异累积引起的。 利用基因芯片进行GWAS研究 问题： 1. 有效性：难以检测到罕见变异（探针设计

4、及低频问题） 2. 可靠性：GWAS 主要依赖统计分析，因此可能会出现比较多的假阳性和 假阴性结果，大量功能实验的验证才是根本解决办法 3. 重复性：不同的群体、不同的研究一致性差 4. 精确性：GWAS 可以确定与性状或疾病相关的位点而非直接确定基因本 身 高通量测序优势高通量测序优势 1. 有效性：高通量测序技术，不局限于已知位点，能够检测未知突变及低 频突变 2. 可靠性：测序准确性高于基因芯片技术，分析结果可靠性更高 3. 重复性：测序重复性较高 4. 精确性：测序不局限于已知位点，能够对特定基因的全部变异情况进行 全面分析，更有利于将疾病与基因关联 1. 全基因组测序：对基因组最全面

5、的分析 2. 外显子组：有效信息率高，利于分析和验证 3. 转录组：基因变异和表达量两个维度的分析 Whole-Exome Sequencing Identifies Rare and Low-Frequency Coding Variants Associated with LDL Cholesterol Leslie A. Lange, Youna Hu, He Zhang, et al. February , 2014 案例案例1 对2005个美国人（其中554个为低密度脂蛋白-胆固醇LDL-C水平最 高307个和最低247个的2%内的极端个体）进行了外显子组测序。 Illumina测序

6、平台双端76bp测序，平均测序深度为127X。 材料与方法材料与方法 发现了LDL-C水平与PNPLA5基因中的罕见低 频突变有关 证实了以往研究中通过传统GWAS方法发现的 PCSK9、LDLR及APOB三个基因与LDL-C水 平的关系，而且在这三个基因中发现了更多的 相关位点。 相关基因变异相关基因变异 文章通过关联分析找出了LDL-C相关的PNPLA5、PCSK9、LDLR及APOB基因上的变 异，也侧面说明了利用外显子组测序进行GWAS分析比传统研究更高效更全面，发现 更多编码区的相关位点。 PNPLA5变异与变异与LDL-C Genome-wide association study

7、 implicates NDST3 in schizophrenia and bipolar disorder 案例案例2 文章利用904个患有精神分裂症和1640个正常的德系犹太人， 进行GWAS分析。 针对最相关的SNP，在已有研究的数据(5,415 schizo-phrenia cases, 4,785 bipolar cases and 12,991 controls)中进行筛选。 针对此SNP，利用转录组测序手段分析其相关的关键基因。 Nov，2013 Manhattan plot 4q26：该区段包含16个强相关SNPs，其中rs11098403相关性最高 Rs11098403：

8、Pgwas=6.55*10-9，odds ratio (OR) for minor (G) allele=1.41 Replication and meta-analysis 利用39个精神分裂症病人，36个躁郁症患者及44个正常对照的小脑组织 进行eQTL研究发现， rs11098403与NDST3的表达量明显相关，而 NDST3编码一个硫酸乙酰肝素代谢过程中的关键酶。 Rs11098403与与NDST3表达表达 对31个人, 20个恒河猴和16个大鼠海马组织进行转录组测序，发现所有人的 rs11098403 附近会产生一个新转录本，这个转录本与NDST3的一个内含子保留 的剪接变体有高度同

9、源性。 可能的机制可能的机制 发生发展机制发生发展机制 Rare coding variants in the phospholipase D3 gene confer risk for Alzheimers disease 为了分析迟发性阿尔兹海默症（LOAD）的相关基因，作者 对14个LOAD家族（每个家族至少4个患者）进行了研究，每 个家族中选取2个患者和1个未受影响的对照进行外显子组测序。 测序采用Illumina HiSeq 2000平台双端测序，平均每个患者 获得160M的reads数。 Jan，2014 案例案例1 两个不相干的家族中共同出现了PLD3基因上的Val232Met变

10、异，在大量数 据库共4,998阿尔兹海默症患者及6,356 对照中进行的调查也发现阿尔兹海 默症患者中存在多种形式的PLD3基因变异，这些变异增高阿尔兹海默症的 患病风险。 PLD3基因变异基因变异 PLD3蛋白通常在脑组织中高表达，尤其是海马和大脑皮层，而在阿尔兹海 默症患者的神经元细胞中表达量则明显降低。 将PLD3过表达于小鼠成神经细胞瘤N2A 细胞系中，细胞间淀粉样蛋白-B前体蛋白 APP明显降低，而利用shRNA敲低PLD3 则使APP表达升高，说明PLD3基因参与 APP的表达过程，而APP的过表达正是阿 尔兹海默症发病的重要原因。 PLD3表达降低表达降低 Jun，2014 mR

11、NA-seq reveals novel molecular mechanisms and a robust fingerprint in Graves disease. J Clin Endocrinol Metab. Graves disease又叫弥漫性毒性甲状腺肿，是一种自身 免疫病，是甲状腺功能亢进的主要原因。文章对9例 Graves disease患者及12例正常的甲状腺组织进行了转录 组测序，测序采用Illuminas HiSeq 2000平台单端100nt测 序。 案例案例2 正常对照样本中参与免疫过程的基因占10.1%，而在患病样本中则增长至18.3%，表明Graves di

12、sease 导致免疫应答增强；应激反应基因由6.8%增长至14.7%，代谢过程基因由47.3%降低至34.0%，推测是 免疫应答增强的下游反应。 差异基因注释差异基因注释 Graves disease中最明显上调 的基因有15个，包括6个HLA基因， 4个细胞因子和趋化因子相关基因， 4个生长合成相关基因及1个未知 功能基因。 差异表达基因差异表达基因 最为相关的通路为免 疫应答，另外病原体 感染、甲状腺生长、 应激反应和第二信使 信号通路的上调也较 为明显，而这些高表 达基因的互做网络显 示，NFkB复合物可能 是这些通路相互作用 中的关键分子。 差异基因互做网络差异基因互做网络 案例案例3

13、 取pilocarpine 诱导 癫痫12周后的大鼠 海马组织 (PIlO, n = 4)及正常对照 (CTrl, n = 5). Deep sequencing reveals increased DNA methylation in chronic rat epilepsy Nov, 2013 差异甲基化分析差异甲基化分析 差异甲基化分析差异甲基化分析 差异表达基因差异表达基因 关键基因关键基因 分子标志物分子标志物 分子标志物是生物过程的指示物。根据分子标志物可以指示判断生物过程、 发病过程以及治疗过程中药理反应。 现在的分子标志物技术很大程度上应用于临床疾病诊断以及愈后预测。 分子标志

14、物分子标志物 案例案例1 Comparative MicroRNA Expression Profiles of Cynomolgus Monkeys, Rat, and Human Reveal that miR-182 Is Involved in T2D Pathogenic Processes 将食蟹猕猴分为两组，一组正常饮食，一组高脂饮食(HFD)诱导糖尿病发 生；根据饮食和最后是否发生T2D，将样本分为四组：intact、intact-T2D、 HFD、HFD-T2D，每组取3只进行miRNA测序，寻找与T2D相关的miRNA。 Nov，2014 T2D组和对照组间的差异miRNA

15、在3个尺度进行比较 ：所有样本、intact组样本、 HFD组样本，共发现24个差异表达的miRNAs，其中13个都是曾在大小鼠中发现的 T2D相关miRNAs。 差异差异miRNAs Intact组 VS HFD组 HFD相关差异相关差异miRNAs 关键关键miRNA：miR-182 案例案例2 Identification of a long non-coding RNA as a novel biomarker and potential therapeutic target for metastatic prostate cancer 从同一病人身上穿刺的不同克隆LTL-313B a

16、nd LTL-313H，进行小鼠 成瘤实验，LTL-313B在4个月内均在局部生长，未表现远处转移，而 LTL-313H则在侵袭至肾脏，并在3个月内发生肺部转移。 差异差异lncRNAs PCAT18特异性特异性 其他肿瘤 雄激素与雄激素与PCAT18 功能验证功能验证 疾病治疗疾病治疗 案例案例 Berberine ameliorates nonalcoholic fatty liver disease by a global modulation of hepatic RNA and lncRNA expression profiles 非酒精性的脂肪肝（NAFLD） 黄连素（盐酸小檗碱） high-fat diet (HFD)-induced steatotic animal model 黄连素对脂肪肝的治疗作用黄连素对脂肪肝的治疗作用 差异表达差异表达RNA 聚类分析聚类分析 共表达网络共表达网络 MRAK052686与与Nrf2共表达共表达 MRAK052686表达变化表达变化 全基因组关联分析（Genome-wide association study，GWAS）是一种对全基因组范围内的遗传变 异基因总体关联分析的方法，