CHAPTER7分子克隆工具酶

1、分子克隆工具酶 The enzymes in the molecular cloning Chapter 7 Chapter7 分子克隆工具酶 限制性核酸内切酶(特异性切割) 甲基化酶(DNA分子的甲基化) DNA聚合酶(合成DNA) 其他分子克隆工具酶(细胞破壁、 核酸纯化等) 第一节 限制性内切酶 1.限制与修饰现象 限制酶的发现 命名： 宿主属名第一个字母(大写) + 种名头两个字母(小写) + 菌株号 + 罗马序号 一、限制与修饰 the 1st such enzyme found Escherichia coli Species category R13 strain How to

2、name a restriction endonuclease? EcoRI 限制性内切核酸酶的命名 名 称 属名 种名 株名 序数 来源菌株 EcoRI E co R I Escherichia coli R HindIII H in d III Haemophilus influenzae HindII H in d II Haemophilus influenzae HindI H in d I Haemophilus influenzae REBASE(The Restriction Enzyme Database) New England Biolabs 限制与修饰系统的种类 II（

3、93%）I（1%）III（1%） 酶分子内切酶与甲基化酶 分子不在一起 三亚基双功 能酶 二亚基双功 能酶 识别位点4-6bp，大多数回 文对称 二分非对称5-7bp非对 称 切割位点在识别位点中或靠 近识别位点 无特异性， 在识别位点 外1000bp 在识别位点 下游24- 26bp 限制反应与 甲基化反应 分开的反应互斥同时竞争 限制反应是 否需要ATP 否是是 5内切酶 3内切酶 ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口 缺口(gap) 切口(nick) 断口(cut) 3HO P53HO P5 1、限制酶识别序列的长度 一般4-8bp，常见6bp ，当识别序列为4或者 6bp时，他们可

4、识别的序列在完全随机的情况下， 平均每44=256和46=4096bp中会出现一个识别 位点。 2、限制酶识别序列的结构 一般为回文对称结构 EcoRI：G AATTC CTTAA G 3、限制酶切割的位置：大多在内部，也有在外部 二、限制酶识别的序列 nConsider a linear DNA molecule with 6 copies of GAATTC: nit will be cut into 7 fragments which could be separated by the gel electrophoresis. (The largest fragment) (The sm

5、allest fragment) digestion of a DNA fragment with endonuclease EcoRI A given molecule will generate a characteristic series of pattern when digested with a set of different enzymes. e.g. the combination of EcoRI + HindIII Use of multiple REs allows different regions of a DNA molecule to be isolated

6、1、匹配黏端(matched end) 识别位点为回文对称结构，产生的末端为匹配 黏端(黏性末端，cohesive end)，形成的两个末 端是相同的，也是互补的。 2、平末端(Blunt end) 在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产 生平末端。 三、限制酶切割产生的末端 (1)Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different. (2)Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus

7、 the frequencies differ. Differences of REs (3) Restriction enzymes differ in : blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端). (4) Restriction enzymes differ in the . Differences of REs sticky ends (粘性末端) blunt ends (平末端) Recognition sequences and cut sites of various endonucleases Cleavage o

8、f an EcoRI site. The 5 protruding ends are said to be “sticky” because they readily anneal through base-pairing to DNA molecules cut with the same enzyme 许多限制酶切割DNA产生非对称突出端。当识别 序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端 是不同的，如BbvC，它的识别切割位点 CCTCAGC GGAGTCG 有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几 种是非对称的。如Acc，它的识别切割位点如 下，GTAT/CGAC CATA/GCTG

9、 3、非对称突出末端 (1)同序同切酶 这些酶识别序列和切割位置都相同。 Hind与Hinc 识别切割位点为 GTYRAC (Y为C或T，R为A或G) Hpa与 Hap 识别切割位点为 CCGG Mob与 Sau3A识别切割位点为 GATC 4、同裂酶(isoschizomer)：识别相同序列的 限制酶称为同裂酶，但切割位点可能不同。 (2)同序异切酶 Kpn 和 Acc65 识别的序列是相同的，但它 们的切割位点不同，分别为： Kpn： GGTACC Acc65： GGTACC 4、同裂酶(isoschizomer) (3)“同功多位” 许多识别简并序列的限制酶包 含了另一种限制酶的功能。

10、如 EcoR识别和切割位点为 GAATTC Apo 识别和切割位点为 RAATTY 后者可识别前者的序列。 4、同裂酶(isoschizomer) (4)其它有些限制酶识别的序列有交叉。 如在 pUC 系列质粒的多克隆位点中有一个 Sal位点（识别切割位点为 GTCGAC），该位 点也可被 Acc位点（识别切割位点为 GTMKAC）和 Hinc位点（识别切割位点为GTYRAC）切割。 4、同裂酶(isoschizomer) 5、同尾酶(isocaudarner) 不同的 限制酶切割DNA产生的末端是相同的， 且是对称的，即它们可产生相同的黏性末端。 BamH I : G GATCC Bgl I

11、I : A GATCT 6、归位内切酶(homing endonuclease) 内含子编码的内切酶。 1、限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别 序列有长度的要求。 2、酶单位：在适合的缓冲液及温度下，在20l 反应体系中反应1h，使1gDNA完全消化所需 要的酶量。 3、在设计PCR引物时，如果要在末端引入酶切位 点，就需要考虑加上一些满足酶切要求的碱基 数目。 四、DNA末端长度对限制酶切割的影响 对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，导 致其对不同位置的同一个识别序列表现出不同 的切割效率。 1、酶切位点对酶的敏感性不同， 2、在切割相同量的不同DNA时所需要的酶量是不 同的。 五

12、、位点偏爱(site preference) 缓冲液：pH、Mg2+、DTT、BSA 反应温度：大多数37 反应时间：1-2h 终止酶切的方法：EDTA、加热、苯酚抽提 去除蛋白、试剂盒纯化DNA。 六、酶切反应条件 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相 似的序列。 1、引起星星活性的因素：甘油浓度过高，酶过量， 离子强度低，pH过高等。 2、抑制方法：减少甘油浓度，减少酶的用量，提 高离子强度，降低pH，保证反应体系无有机溶 剂等。 七、星星活性(star activity) l 部分切割双链DNA的酶也可以消化单链，但切 割效率不同或降低。 l 某些限制酶只切割双链DNA中的一条链

13、，产生 单链缺口，即切口酶，命名时在前面加上一个N。 八、单链DNA的切割 1、将产生的5突出末端补平后，再连接可产生新 的酶切位点。 2、同尾末端的连接：不同的同尾酶切割DNA产生 的末端再相互连接时，可产生新的酶切位点， 同时原来的酶切位点消失。 3、平末端连接产生新的酶切位点 Pvu II (CAGCTG) +EcoR V (GATATC) Mbo I: GATC 九、酶切位点的引入 1、外部因素(可预见和控制) 反应条件、底物纯度、酶量、反应体积、反应时 间等 2、内部因素 星星活性、底物甲基化和底物的构象(切割线性 DNA和超螺旋DNA的活性差异) 十、影响酶活性的因素 第二节 甲基

14、化酶 1、Dam甲基化酶 在GATC序列中的腺嘌呤N6位置引入甲基。 某些限制酶的识别位点含GATC序列，对Dam甲基 化的DNA敏感，不能切割相应的序列。 一般哺乳动物DNA不会在腺嘌呤N6上甲基化，因 此不受影响。 当需要在这些敏感位点完全切割DNA时，可利用 dam型E.coli扩增并提取DNA。 一、甲基化酶的种类(methylase) 2、Dcm甲基化酶。识别CCAGG或CCTGG序列， 在第二个胞嘧啶C的C5位置引入甲基。受Dcm甲 基化作用影响的酶有EcoRII (CCWGG)，但其 同裂酶不受影响，因其切点不同。 3、EcoK I甲基化酶，其识别位点少，识别 AAC(N)6GT

15、GC和GCAC(N)6GTT序列中A的N6 位置。 4、Sss I甲基化酶，来源于原核螺原体，可使CG 序列中的C在C5位置上甲基化。 一、甲基化酶的种类(methylase) 二、依赖于甲基化的限制系统 1、E.coli：McrA，McrBC和Mrr，识别序列不同， 但只识别经过甲基化的序列，都限制由CG甲基 化酶(M.SssI)作用的DNA。 McrA：限制HpaII甲基化修饰的位点。 McrBC：限制两套半位点(G/A) m5C。 Mrr：限制m6A。 三、甲基化对限制酶酶切的影响 修饰酶切位点 主要使酶切位点甲基化，而不受限制性核酸内切酶 的切割。 2.产生新的酶切位点 有些酶是依赖甲

16、基化的限制酶，因此甲基化后可产 生新的酶切位点。 第三节 DNA聚合酶 DNA polymerase主要功能：催化 DNA的合成 l 真核生物五种： 、 l 原核生物三种： DNA聚合酶I,II和III 1、活性：大肠杆菌DNA聚合酶I为单链多肽，相 对分子质量为109103，有三种活性：53 DNA聚合酶活性，53 外切核酸酶活性，3 5 外切核酸酶活性。 交换反应：如果只有一种dNTP存在，3 5外切 核酸酶活性将从3-OH端降解DNA，然后在该 位置发生一系列连续的合成和外切反应，直到 露出与该dNTP互补的碱基。 一、大肠杆菌聚合酶I (1)利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53外切核酸 酶

17、活性，可用切口平移法标记DNA，用作杂 交探针。 方法：在Mg2存在下用DNaseI处理双链DNA 模板，产生少量切口，在切口处，利用DNA 聚合酶I的53外切核酸酶活性使切口沿5 3平移，同时产生的切口可作为DNA聚合 酶I催化合成DNA的引物。合成过程中，标 记的dNTP不断加入到DNA链上，可作为杂 交探针。 2、大肠杆菌DNA聚合酶I的用途 (2)用于cDNA克隆中第二链合成 利用聚合酶活性。但已被淘汰，改用Klenow酶或 反转录酶。 (3)对3突出末端的DNA作末端标记 利用交换反应。现改用T4或T7 DNA聚合酶。 2、大肠杆菌DNA聚合酶I的用途 二、Klenow DNA聚合酶

18、 是大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶裂解后， 从全酶中除去53外切酶活性的肽段 后的大片段肽段，其聚合活性和35 外切酶活性不受影响，相对分子质量为 76103。 可利用基因工程生产。 (1)补平DNA的3凹端。(利用DNA聚合酶活性，要 加足够的dNTP，如带标记，则可进行末端标 记) (2)抹平DNA的3凸端。(3-5外切核酸酶活性，切 除3凸端，要加足够的dNTP。T4和T7 DNA 聚合酶可替代) (3)通过置换反应对DNA进行末端标记 (4)随机引物标记(聚合酶活性) (5)其他用途，如测序，cDNA合成第二链。 Klenow DNA聚合酶作用 三、T4噬菌体 DNA聚合酶 T4 ph

19、age DNA polymerase来源于T4噬 菌体感染的大肠杆菌， 相对分子质量为114103，活性与Klenow DNA聚合酶相似， 但其35外切核酸酶活性强200倍，且不 从单链DNA模板上替换引物，常用于诱 变反应。 四、T7噬菌体 DNA聚合酶 来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌，是由两种紧密 结合的蛋白质形成的复合体，一种是噬菌体基 因5编码的蛋白，另一个是宿主细胞的硫氧还 原蛋白。 活性与T4噬菌体DNA聚合酶和Klenow DNA聚合 酶相似，但其35外切核酸酶活性为Klenow DNA聚合酶1000倍，可替代T4噬菌体DNA 聚合酶功能并可用于模板的引物延伸。 五、耐热 DNA

20、聚合酶 在高温下具有活性的DNA聚合酶，来自嗜 高温的细菌，主要用于PCR反应。 Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶。 六、反转录酶(reverse transcriptase) 依赖于RNA的DNA聚合酶， 有53合成DNA活性， 无35外切酶活性。 来自AMV(禽成髓细胞瘤病毒) 和Mo-MLV (Moloney鼠白血病病毒，又称 M-MuLV)。 具有53聚合酶活性和很强的RNase H活性(特 异性水解DNA:RNA杂交链上RNA链的磷酸 二酯键，产生5核苷酸，该酶对单链的核酸、 双链DNA或双链RNA没有作用

21、)。 cDNA合成起始：引物和mRNA模板杂交体可成 为RNase H的底物，模板的降解和cDNA的 合成相竞争。 反应终止:RNase H可在正在增长的 DNA3端 切割模板，抑制cDNA的合成。 AMV反转录酶 RNase H缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒 (M-MuLV)反转录酶是一种RNA介导的 DNA聚合酶。 该酶能以RNA(合成cDNA时)或单链DNA 做模板由引物起始合成一个互补的DNA 链。RNase H活性的缺失增强了该酶合 成长链cDNAs的能力。 M-MuLV反转录酶 反转录酶的活性 3DNA聚合酶活性(需Mg2+)，即以RNA 或DNA为模板及带3-OH的RNA或DNA引物

22、 合成DNA。 53和35外切核酸酶活性，产生含5磷 酸及3-OH的长420个碱基的核苷酸。 无35外切核酸酶校正作用，在高浓度 dNTP等条件下每500个碱基会有一个错误的 掺入。 七、末端转移酶(terminal ransferase) 来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期 的类淋巴样细胞内的一种DNA聚合酶，不依赖 于模板的DNA聚合酶。 在2价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于 DNA分子的3-OH端。若dNTP为T或C，首选 Co2，若dNTP为A或G，首选Mg2。 可在cDNA或载体的3末端加同聚尾，便于克隆， 也可用标记的rNTP、dNTP或ddNTP来标记 DNA

23、片段的3末端。 第四节 其他分子克隆工具酶 包括：SP6噬菌体RNA聚合酶、T4噬菌体RNA聚 合酶、T7噬菌体RNA聚合酶。 活性：识别DNA中各自特异的启动子序列，并沿此 DNA模板起始RNA的合成，无需引物。 用途：体外合成RNA分子，表达外源基因。 一、依赖于DNA的RNA聚合酶 二、连接酶(ligase) 1.T4 DNA连接酶 催化DNA5磷酸基与3羟基形成磷酸二酯键， 反应底物为黏端、切口、平末端的RNA 或者DNA。 2.大肠杆菌DNA连接酶 需NAD+的参与，作cDNA克隆时，不会将 RNA连接到DNA，不连接RNA。 3.Taq DNA连接酶 在两个核苷酸之间进行连接反应，

24、同时必须 与另一DNA链形成杂交体，相当于连接 双链DNA中的缺口，作用在45-65， 需NAD+,主要用于在PCR扩增中引入寡 核苷酸。 二、连接酶(ligase) 4.T4 RNA连接酶 可以催化单链DNA或RNA的5磷酸与另一 单链DNA或RNA的3羟基形成共价连接， 用于标记RNA的3末端、单链DNA或 RNA的连接等。 二、连接酶(ligase) 三、T4多核苷酸激酶 T4 polynucleotide kinase 是一种磷酸化酶，可 将ATP的-磷酸基团转移至DNA或者RNA的 5末端: 1.正反应：将ATP的-磷酸基团转移至无磷酸的 DNA的5末端，用于对缺乏5磷酸的DNA进 行磷酸化。 2.交换反应：在过量ATP存在的情况下，将DNA 的5端磷酸转移给ADP,然后DNA从ATP上获 得-磷酸而重新磷酸化。 四