免疫组化及特殊染色

1、免疫组化及特殊染色 免疫组织化学技术免疫组织化学技术 Immunohistochemistry Immunohistochemistry techniques techniques 免疫组化及特殊染色 第一节第一节 免疫组织化学免疫组织化学 技术概述技术概述 免疫组化及特殊染色 （一）发展简史（一）发展简史 n19411941年年CoonsCoons首先用荧光素标记抗体检测首先用荧光素标记抗体检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 n6060年代年代NakaneNakane建立酶标抗体技术运用铁建立酶标抗体技术运用铁 蛋白标记蛋白标记AbAb技术技术 n70 70

2、、80年代多位科学家改良上述技术，年代多位科学家改良上述技术， 建立辣根过氧化物酶建立辣根过氧化物酶-抗过氧化物酶抗过氧化物酶 （PAPPAP）技术）技术, ,抗生物素抗生物素生物素（生物素（ABC） 法法使免疫组织化学进入了应用阶段。使免疫组织化学进入了应用阶段。 免疫组化及特殊染色 n20002000年以后各种免疫组化技术更加成熟年以后各种免疫组化技术更加成熟, , 使免疫组化技术成为当今生物医学中形使免疫组化技术成为当今生物医学中形 态、功能代谢综合研究的一项有力工具。态、功能代谢综合研究的一项有力工具。 其应用范围深达医学各个学科，是目前其应用范围深达医学各个学科，是目前 生命科学工作

3、者应该掌握的基本技术之生命科学工作者应该掌握的基本技术之 一。一。 免疫组化及特殊染色 定义定义: :是应用是应用免疫学免疫学基本原理基本原理抗原抗原抗体反应，即抗原与抗体抗体反应，即抗原与抗体 特异性结合的原理，通过化学反应使特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体标记抗体的显色剂的显色剂(荧光荧光 素、酶、金属离子、同位素素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原（多显色来确定组织细胞内抗原（多 肽和肽和蛋白质蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫免疫 组织化学技术组织化学技术(immunohistochemistry)或或免疫细

4、胞化学技免疫细胞化学技 术术(immunocytochemistry)。 将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记，将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记， 在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体 复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作 用，进一步提高了免疫技术的敏感性。用，进一步提高了免疫技术的敏感性。 （二）免疫组织化学的原理（二）免疫组织化学的原理 免疫组化及特殊染色 n抗原抗原是指能够刺激是指能够刺激机体机体产生（特异性）产生

5、（特异性） 免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和 致敏淋巴细胞在体内外结合，发生致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫免疫 效应效应（特异性反应）的物质。抗原的基（特异性反应）的物质。抗原的基 本特性有两种，一是诱导免疫应答的能本特性有两种，一是诱导免疫应答的能 力，也就是免疫原性，二是与免疫应答力，也就是免疫原性，二是与免疫应答 的产物发生反应，也就是抗原性的产物发生反应，也就是抗原性 免疫组化及特殊染色 n病原微生物病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行在医疗中将病原微生物制成疫苗进行 预防预防接种接种，可以提高人的，可以提高人的免疫力免疫力。 n嗜异性抗

6、原嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人一类与种属特异性无关的、存在于人 以及某些以及某些动物动物、植物植物、微生物的性质相同的抗原。、微生物的性质相同的抗原。 n肿瘤抗原肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发由物理的、化学的因素或某些病毒诱发 的的实验动物实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性 抗原，称为抗原，称为肿瘤特异性抗原肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤。已证实在某些人类肿瘤 中心存在着与病毒密切相关的抗原。中心存在着与病毒密切相关的抗原。 n同种异体抗原同种异体抗原 n动物免疫血清动物免疫血清 与人类有关的抗原与人类有关的抗原

7、 免疫组化及特殊染色 n抗体抗体（antibody）指机体的免疫系统在）指机体的免疫系统在 抗原抗原刺激下，由刺激下，由B淋巴细胞或淋巴细胞或记忆细胞记忆细胞增增 殖分化成的殖分化成的浆细胞浆细胞所产生的、可与相应所产生的、可与相应 抗原发生抗原发生特异性特异性结合的免疫球蛋白。结合的免疫球蛋白。 免疫组化及特殊染色 世界著名抗体公司世界著名抗体公司 n Santa公司、 公司、Abcam公司、公司、 n Abgent公司、 公司、Proteintech Group、 Cell Signaling Technology（ （CST）、）、 n 罗氏公司（罗氏公司（Roche） 免疫组化及特殊染

8、色 它借助于它借助于荧光素、酶荧光素、酶等标记抗体等标记抗体 与组织切片或细胞涂片中相关与组织切片或细胞涂片中相关抗原抗原相相 结合，由于荧光素所发荧光可用荧光结合，由于荧光素所发荧光可用荧光 显微镜检出，而酶可经一定的显色处显微镜检出，而酶可经一定的显色处 理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准 确定位欲测定的抗原物质。确定位欲测定的抗原物质。 标记物标记物 免疫组化及特殊染色 荧光素、酶荧光素、酶 标记标记 抗抗 体体 抗抗 原原 荧光荧光 阳性色彩阳性色彩 显微镜观察显微镜观察 组织抗原组织抗原抗体抗体 酶酶荧光素荧光素 免疫组化及特殊染色 三大系统三大系统 本

9、技术是应用免疫学原理本技术是应用免疫学原理 来识别待测抗原，再通过酶和底物来识别待测抗原，再通过酶和底物 的作用外加显色剂，将上述反应显的作用外加显色剂，将上述反应显 示出来。示出来。 免疫组化及特殊染色 免疫组免疫组 织化学织化学 识别系统识别系统 联结系统联结系统 显示系统显示系统 免疫组化及特殊染色 n识别系统识别系统是指特异性抗体识别组织是指特异性抗体识别组织 或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特 异性结合是本技术的基本依异性结合是本技术的基本依据。据。 免疫组化及特殊染色 n联结系统联结系统由联结抗体构成。它的作由联结抗体构成。它的作 用是联接识别系统和显示系

10、统。用是联接识别系统和显示系统。 免疫组化及特殊染色 n显示系统显示系统的目的是使抗原抗体间的的目的是使抗原抗体间的 特异性结合变为肉眼可见。因此显特异性结合变为肉眼可见。因此显 示系统由示系统由标记酶，底物和显色剂组标记酶，底物和显色剂组 成成，以在靶抗原存在位点上形成有，以在靶抗原存在位点上形成有 色沉淀。色沉淀。 免疫组化及特殊染色 特点特点： 特异性强特异性强 灵敏度高灵敏度高 定位准确和简便快速等优点定位准确和简便快速等优点 又能够将形态、功能及代谢的研又能够将形态、功能及代谢的研 究有机结合起来。究有机结合起来。 免疫组化及特殊染色 IHC方法方法 1 1 过去用过的方法过去用过的

11、方法ABCABC法，法，SPSP法法。三步三步 法，使用生物素法，使用生物素 2 2 目前最常用的方法目前最常用的方法二步法：二步法： EnliVisionEnliVision 显色系统显色系统（即用型非生物素免疫组化（即用型非生物素免疫组化 EnliVisionTM plusEnliVisionTM plus检测试剂盒检测试剂盒 ） n将多个抗鼠和抗兔的将多个抗鼠和抗兔的IgGIgG分子二抗与辣根过氧分子二抗与辣根过氧 化物酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个大化物酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个大 分子多聚体（分子多聚体（polymerpolymer），直接放大信号），直接放大信号40-5

12、040-50 倍。倍。 n敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生 物素干扰）。物素干扰）。 免疫组化及特殊染色 3 3 最新一代的免疫组化最新一代的免疫组化 Novolink Polymer Novolink Polymer法：法： 使用小分子聚合物（减少细胞薄膜硬脂的阻使用小分子聚合物（减少细胞薄膜硬脂的阻 碍，比传统中的大分子聚合物染色更显著），碍，比传统中的大分子聚合物染色更显著）， 信号放大更强，还可以检测到组织中低浓度信号放大更强，还可以检测到组织中低浓度 的抗原。的抗原。 IHC方法方法 免疫组化及特殊染色 EnliVisionEnliVi

13、sion法的工作程序法的工作程序： 切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸，切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸， APESAPES） nH H2 2O O2 2处理（处理（阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗 n组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化暴露出暴露出 抗原决定簇），抗原决定簇），TBSTBS漂洗漂洗 n内源性过氧化物酶的阻断内源性过氧化物酶的阻断 n一抗孵育，一抗孵育，TBSTBS漂洗漂洗 n二抗孵育，二抗孵育，TBSTBS漂洗漂洗 nDABDAB显色，蒸馏

14、水中止反应显色，蒸馏水中止反应 n苏木素复染及封片苏木素复染及封片 IHCIHC技术的基本操作流程技术的基本操作流程 免疫组化及特殊染色 切片切片烤片烤片脱蜡水化脱蜡水化 H H2 2O O2 2处理处理 热修复热修复 一抗一抗 二抗二抗 EnlivisionEnlivision试剂试剂DABDAB显色显色 苏木素复染苏木素复染 免疫组化及特殊染色 IHCIHC染色结果的判读原则染色结果的判读原则 免疫组化及特殊染色 玻片干燥造成的玻片干燥造成的“边缘效应边缘效应” 假假 阳阳 性性 未阻止内源性过氧化物酶未阻止内源性过氧化物酶 阻止内源性过氧化物酶后阻止内源性过氧化物酶后 I. I. 注意影

15、响注意影响IHCIHC结果判读的因素结果判读的因素 免疫组化及特殊染色 酒精固定酒精固定 福尔马林固定福尔马林固定 胰腺，胰腺，insulin平滑肌肉瘤，平滑肌肉瘤，SMA 气泡影响抗体抗体反应气泡影响抗体抗体反应 冰冻切片冰冻切片 石蜡切片石蜡切片 结肠，结肠，CEA 假阴性：注意内对照假阴性：注意内对照 免疫组化及特殊染色 假假 阴阴 性性 蛋白酶处理后蛋白酶处理后 蛋白酶未处理蛋白酶未处理 皮肤，皮肤，IV胶原胶原甲状旁腺，甲状旁腺，PTH 微波未处理微波未处理 微波处理后微波处理后 免疫组化及特殊染色 II. II. 染色的特异性判定染色的特异性判定 免疫组化及特殊染色 免疫组化及特殊

16、染色 免疫组化及特殊染色 免疫组化及特殊染色 MitochondoriaMitochondoria ApicalApical membranemembrane Basolateral Basolateral membranemembrane Plasma Plasma MembraneMembrane + + PERPER GolgiGolgi Plasma Plasma membranemembrane PER + PER + GolgiGolgi GolgiGolgi apparatusapparatus EndocrineEndocrine granulegranule Endocrin

17、e granuleEndocrine granule LysosomeLysosome CytosolCytosolNucleusNucleusCytoskeletoCytoskeleto n n l amylaseamylase l lysozome lysozome l PAcP PAcP l S-100 S-100 l NSE NSE l prefixation prefixation diffusion diffusion artifact artifact l CEACEA l EMA EMA l ALP ALP lCD10CD10 l cytochromecytochrome P-

18、450 P-450 l immunogloblinimmunogloblin l AFP AFP l HCG HCG l factor -RA factor -RA l prolactin in prolactin in activated pituicyte activated pituicyte l SCSC l EGFR EGFR lE-cadE-cad l Leu 4Leu 4 l HLA-DR HLA-DR l CEA, EMA, CEA, EMA, SC, CA19-9 SC, CA19-9 in cancer cell in cancer cell l Leu 1Leu 1 l

19、LCA LCA l PALP in PALP in seminoma seminoma cell cell lCerb-B2Cerb-B2 l SC, AFPSC, AFP EMA, EMA, immunoglobulin immunoglobulin in special in special conditions conditions l chromogranin Achromogranin A l serotonin serotonin l Peptide Peptide hormonehormone l DNA polymerase DNA polymerase l S-100 (oc

20、casional) S-100 (occasional) l estrogen receptor estrogen receptor l keratin inkeratin in carcinoid, carcinoid, mesothelioma mesothelioma l vimentin vimentin l keratin inkeratin in adenocarcinomaadenocarcinoma hepatocyte hepatocyte l actin actin l keratinkeratin l vimentin vimentin l GFAP GFAP l tub

21、ulin tubulin 免疫组化及特殊染色 细胞膜阳性细胞膜阳性 n细胞粘附分子：细胞粘附分子： E-cadherin E-cadherin、CD31CD31、CD56CD56等等 n交联膜蛋白分子：交联膜蛋白分子：catenincatenin、dystrophin dystrophin 等等 n细胞表面受体：细胞表面受体：EGFREGFR、c-erbB2c-erbB2、c-kit/CD117c-kit/CD117 （酪氨酸激酶受体）等酪氨酸激酶受体）等 n绝大多数白细胞抗原绝大多数白细胞抗原: : LCA LCA、CD20CD20、CD2CD2、CD5CD5等等 n表面或跨膜蛋白：表面或跨

22、膜蛋白：VillinVillin、BerEP4BerEP4、EMAEMA、 CEA CEA、 CA125CA125、EBV-LMP1EBV-LMP1等等 免疫组化及特殊染色 细胞核阳性细胞核阳性 n细胞周期素蛋白细胞周期素蛋白：cyclinscyclins、cyclin cyclin 依赖激依赖激 酶酶( (cdk)cdk)、cdk cdk 抑制剂抑制剂 ( (如如 p16)p16)等等 n细胞增殖相关蛋白细胞增殖相关蛋白：Ki67Ki67、PCNAPCNA n转录因子转录因子：MyoD1MyoD1、myogeninmyogenin、TTF-1TTF-1、CDX2CDX2、 PAX5PAX5

23、n肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因：如：如 p53p53、p63p63、RbRb、WT1WT1 n基因错配产物基因错配产物：如：如 MLH1MLH1、MSH2MSH2 免疫组化及特殊染色 n细胞核酶细胞核酶：如 TdT n类固醇激素受体类固醇激素受体：如 ER、PR、AR n细胞核钙结合蛋白细胞核钙结合蛋白：如 S100蛋白、calretinin n定位细胞核的病毒定位细胞核的病毒：如 CMV、HBcAg（核+核周） nNeuN：neuronal nuclei，表达于成熟的神经元 免疫组化及特殊染色 细胞浆内颗粒状阳性细胞浆内颗粒状阳性-定位于细胞器定位于细胞器 n溶酶体颗粒溶酶体颗粒：如 lysoz

24、yme、CD68、myeloperoxidase n黑色素小体和前黑色素小体黑色素小体和前黑色素小体：如 HMB45、Melan-A n细胞毒颗粒细胞毒颗粒：如TIA-1、granzyme B n线粒体线粒体: 如抗线粒体抗体, HEP-PAR1 n神经内分泌颗粒神经内分泌颗粒：各种激素（如PTH、 ACTH、 insulin）、CgA、Syn nW-P W-P 小体小体: F-VIII相关抗原 n分泌颗粒分泌颗粒：如BRST-2、surfactant、PSA n细胞内微生物细胞内微生物：如弓形虫 免疫组化及特殊染色 细胞浆纤维状阳性细胞浆纤维状阳性-中间丝或微丝中间丝或微丝 中间丝中间丝;C

25、K;CK; ;VimentinVimentin; ;DesminDesmin GFAPGFAP（glial fibrillary acidic proteinglial fibrillary acidic protein， 胶质纤维酸性蛋白胶质纤维酸性蛋白 ） NFNF（NeurofilamentNeurofilament，神经元胞浆，神经元胞浆节细胞节细胞 神经瘤，副节瘤神经瘤，副节瘤/ /嗜铬细胞瘤嗜铬细胞瘤，神经母细胞，神经母细胞 瘤）瘤） NestinNestin：巢蛋白，神经前体细胞巢蛋白，神经前体细胞 免疫组化及特殊染色 弥漫或片状的细胞浆阳性弥漫或片状的细胞浆阳性 n蛋白分布在细

26、胞内液、大量的微囊及内质蛋白分布在细胞内液、大量的微囊及内质 网中网中 n如如: :myoglobinmyoglobin、hemoglobinhemoglobin、albuminalbumin、 AFPAFP、 NSENSE、cytoplasmic Igcytoplasmic Ig、CD3CD3 n病毒颗粒病毒颗粒/ /蛋白蛋白 n如如: :HBsAgHBsAg（常在核旁着色）（常在核旁着色） n从细胞间液吸收的蛋白从细胞间液吸收的蛋白 n如如: : IgIg、 albuminalbumin 免疫组化及特殊染色 分化差恶性肿瘤的诊断和鉴别诊断；分化差恶性肿瘤的诊断和鉴别诊断； 证实内分泌肿瘤和

27、神经内分泌肿瘤；证实内分泌肿瘤和神经内分泌肿瘤； 应用肿瘤胚胎性抗原诊断某些肿瘤，如癌应用肿瘤胚胎性抗原诊断某些肿瘤，如癌 胚抗原（胚抗原（CEACEA）对胃肠道癌、甲胎蛋白（）对胃肠道癌、甲胎蛋白（AFPAFP） 对肝癌和卵巢内胚窦癌诊断有帮助；对肝癌和卵巢内胚窦癌诊断有帮助； （三）免疫组化的应用（三）免疫组化的应用 免疫组化及特殊染色 有时可帮助确定肿瘤的良恶性，如应用免有时可帮助确定肿瘤的良恶性，如应用免 疫球蛋白轻链疫球蛋白轻链和和来鉴别滤泡性恶性淋来鉴别滤泡性恶性淋 巴瘤和滤泡性反应性增生；巴瘤和滤泡性反应性增生； 研究某些癌症与病毒的关系，如肝癌与乙研究某些癌症与病毒的关系，如肝

28、癌与乙 型肝炎病毒、鼻咽癌与型肝炎病毒、鼻咽癌与EBEB病毒、宫颈癌与病毒、宫颈癌与 乳头状瘤病毒等的关系；乳头状瘤病毒等的关系； 免疫组化及特殊染色 为肿瘤治疗的选择提供依据，如乳腺为肿瘤治疗的选择提供依据，如乳腺 癌检测雌、孕激素受体（癌检测雌、孕激素受体（ERER、PRPR）呈阳）呈阳 性时，应用他莫昔芬（三苯氧胺）治疗性时，应用他莫昔芬（三苯氧胺）治疗 可预期获得较好的疗效；可预期获得较好的疗效； 检测癌基因和抑癌基因蛋白产物（如检测癌基因和抑癌基因蛋白产物（如 c-erbB2c-erbB2，p53p53）、增生活性抗原（如）、增生活性抗原（如 Ki-67Ki-67，PCNAPCNA）

29、用来估计肿瘤的预后。）用来估计肿瘤的预后。 免疫组化及特殊染色 免疫组化在临床诊断中免疫组化在临床诊断中 应用病例示范（应用病例示范（Case 1Case 1） n临床病史资料：临床病史资料：4848岁，男性，胃活检标岁，男性，胃活检标 本取自胃大弯部位。本取自胃大弯部位。H ; 浸蜡及包埋过程中浸蜡及包埋过程中, ,石蜡温度应保持在石蜡温度应保持在6060或或 6060以下以下, ,用熔点低的石蜡包埋用熔点低的石蜡包埋; ; 制备蜡块在较低的温度进行制备蜡块在较低的温度进行, ,故试剂处理时应故试剂处理时应 适当延长适当延长, ,否则会给切片带来困难否则会给切片带来困难 免疫组化及特殊染色

30、常用的包埋法常用的包埋法 石蜡包埋石蜡包埋 冰冻干燥包埋冰冻干燥包埋 塑料包埋塑料包埋 免疫组化及特殊染色 （四）组织切片中载玻片的处理（四）组织切片中载玻片的处理 n 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射 n等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证 n试验的正常进行，可选用试验的正常进行，可选用Poly-L-Lysine Poly-L-Lysine 、 nZLI-9001 APESZLI-9003 HistogripTMZLI-9001 APESZLI-9003 HistogripTM或或 nZLI-9005 ZLI-9

31、005 等几种试剂，对已常规清洗的载等几种试剂，对已常规清洗的载 n玻片进行处理。具体方法如下：玻片进行处理。具体方法如下： 免疫组化及特殊染色 Poly-L-LysinePoly-L-Lysine：将洗净、干燥的：将洗净、干燥的 载玻片放入以载玻片放入以1:101:10比例去离子水稀比例去离子水稀 释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5 5分分 钟，钟，6060o oC C烤箱烘烤一小时或室温过烤箱烘烤一小时或室温过 夜干燥。装盒备用。试验中使用的夜干燥。装盒备用。试验中使用的 器具均为非玻璃制品。器具均为非玻璃制品。 免疫组化及特殊染色 （五）抗原修复（五）抗原修复 n 抗

32、原修复是指石蜡、冰冻、火抗原修复是指石蜡、冰冻、火 棉胶、塑料切片免疫组织化学（棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHCIHC） 前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、 微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖 的抗原决定簇或变性的抗原重新暴的抗原决定簇或变性的抗原重新暴 露或抗原性得到一定程度的恢复过露或抗原性得到一定程度的恢复过 程。程。 免疫组化及特殊染色 石蜡切片为什么要做抗原修复？有那些方法石蜡切片为什么要做抗原修复？有那些方法 ？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内 抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原

33、决抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决 定簇定簇, ,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇 隐蔽隐蔽. .所以要求在进行所以要求在进行IHCIHC染色时染色时, ,需要先进行需要先进行 抗原修复或暴露抗原修复或暴露, ,即将固定时分子之间所形成即将固定时分子之间所形成 的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 免疫组化及特殊染色 常用的抗原修复方法有常用的抗原修复方法有微波修复法，微波修复法， 高压加热法，酶消化法，水煮加热高压加热法，酶消化法，水煮加热 法法等，常用的修复液是等，常用的修复液是pH6.0pH6.0的的 0

34、.01mol/L0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。的柠檬酸盐缓冲液。 免疫组化及特殊染色 抗原修复方法抗原修复方法 一、热修复一、热修复 n1 1、微波炉加热法、微波炉加热法 将玻片分别插入抗原修复盒中，以保证各将玻片分别插入抗原修复盒中，以保证各 部位的玻片受热均匀。部位的玻片受热均匀。 n在抗原修复盒中加入抗原修复液，盖上带有在抗原修复盒中加入抗原修复液，盖上带有 小孔的盖子。小孔的盖子。 n将塑料盒置于微波炉中央，加热将塑料盒置于微波炉中央，加热 2x5min 2x5min 。 两次加热之间，加入两次加热之间，加入 50ml 50ml 蒸馏水。蒸馏水。 加热加热 过程中，组织标本不可干

35、燥。过程中，组织标本不可干燥。 免疫组化及特殊染色 第二次处理后，将微波炉中的修复盒移至第二次处理后，将微波炉中的修复盒移至 室温冷却室温冷却 15-20 15-20 分钟。分钟。 不要打开盖子！不要打开盖子！ 蒸馏水冲洗。蒸馏水冲洗。 阻断内源性过氧化物酶并置于蒸馏水中。阻断内源性过氧化物酶并置于蒸馏水中。 用用 TBS TBS 或或 PBS PBS 液冲洗。液冲洗。 进行免疫组化染色。进行免疫组化染色。 免疫组化及特殊染色 在压力锅中放入在压力锅中放入 1500-3000ml 1500-3000ml 抗原修抗原修 复缓冲液加热到沸腾，不加阀，玻片插入复缓冲液加热到沸腾，不加阀，玻片插入 切

36、片架并放入沸腾的修复缓冲液中。后加切片架并放入沸腾的修复缓冲液中。后加 阀，使之加压阀，使之加压2 2分钟。后将压力锅置于流分钟。后将压力锅置于流 水槽或继续冷却水槽或继续冷却 20 20 分钟（减压）。取出分钟（减压）。取出 切片，蒸馏水冲洗，移至切片，蒸馏水冲洗，移至 TBS TBS 或或 PBS PBS 液液 中，以避免组织干燥。中，以避免组织干燥。 以下同微波炉修复法以下同微波炉修复法 。 2、压力锅法、压力锅法 免疫组化及特殊染色 n 抗原修复的方法选择，关系到组织抗原修复的方法选择，关系到组织 抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色 效果有很大影响。因

37、此应当根据不同的效果有很大影响。因此应当根据不同的 抗原特点，采用不同的修复方法。对某抗原特点，采用不同的修复方法。对某 些细胞内抗原（如些细胞内抗原（如FasFas、BaxBax、FF等）和等）和 细胞间质抗原（如细胞间质抗原（如LamininLaminin、CoIVCoIV等）则等）则 需要用酶消化法处理切片。需要用酶消化法处理切片。 二、酶消化方法二、酶消化方法 免疫组化及特殊染色 n1 1、胰蛋白酶处理：、胰蛋白酶处理： nA A 滴加一滴胰蛋白酶工作液于组织上。滴加一滴胰蛋白酶工作液于组织上。 nB B 室温室温 37 37 孵育孵育 20-40 20-40 分钟，孵育时间分钟，孵育

38、时间 的长短依福尔马林固定时间及所测抗原情况的长短依福尔马林固定时间及所测抗原情况 而定。而定。 nC C 蒸馏水冲洗，终止反应。蒸馏水冲洗，终止反应。 nD D 阻断内源性过氧化物酶。阻断内源性过氧化物酶。 nE E 免疫组化染色。免疫组化染色。 免疫组化及特殊染色 n2 2、胃蛋白酶处理、胃蛋白酶处理 nA A 滴加胃蛋白酶工作液于组织上。滴加胃蛋白酶工作液于组织上。 nB B 最佳消化时间取决于福尔马林的固定最佳消化时间取决于福尔马林的固定 时间，时间， 37 37 预热。一般消化预热。一般消化 10 10 分钟，分钟， 长至长至 30 30 分钟。分钟。 nC C 以下同胰蛋白酶处理方

39、法以下同胰蛋白酶处理方法 3 ,4,5 3 ,4,5 。 n注：过度消化将导致组织结构的丢失，注：过度消化将导致组织结构的丢失， 并引起组织脱片并引起组织脱片 免疫组化及特殊染色 三、综合方法三、综合方法 n微波炉加胰酶修复法：微波炉加胰酶修复法： n将组织切片置于盛有将组织切片置于盛有 50ml 50ml 修复液的塑料盒中，封修复液的塑料盒中，封 口膜封口后加热口膜封口后加热 5 5 分钟。分钟。 n冷却后打开，将切片置于冷却后打开，将切片置于 37 37 预热的蒸馏水中，预热的蒸馏水中， 胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化。 n室温胰蛋白酶处理室温胰蛋白酶处理 30 30 秒钟。秒钟。 n蒸馏水冲

40、洗。蒸馏水冲洗。 n阻断内源性过氧化物酶，置蒸馏水中。阻断内源性过氧化物酶，置蒸馏水中。 n免疫组化染色。免疫组化染色。 免疫组化及特殊染色 操作中还应注意如下问题：操作中还应注意如下问题： n 1 1、热处理后应注意自然冷却。、热处理后应注意自然冷却。 2 2、热处理时要防止切片干燥。、热处理时要防止切片干燥。 3 3、应根据不同的抗体选择合适的抗原修、应根据不同的抗体选择合适的抗原修 复方法。复方法。 4 4、一批抗原的检测其温度和时间一定保、一批抗原的检测其温度和时间一定保 持一致。持一致。 免疫组化及特殊染色 n5 5、注意形态学结构的改变、注意形态学结构的改变( (一般经高温修复后一

41、般经高温修复后 胞浆会无明显的破坏，而对细胞核的影响较大，胞浆会无明显的破坏，而对细胞核的影响较大， 会出现核破裂，苏木素淡染等现象，而经酶水会出现核破裂，苏木素淡染等现象，而经酶水 解的切片，其细胞浆破坏视消化时间而异，但解的切片，其细胞浆破坏视消化时间而异，但 核破坏较轻核破坏较轻) )。 6 6、如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，、如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复， 或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不 常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如EDTAEDTA等可等可 改善某些抗原的修复。改善某些抗原的修复。 免疫组化及特殊染色 n操作中应注意以下问题：操作中应注意以下问题： 1.1.石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。 2.2.消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。 3.PBS3.PBS洗涤要充分。洗涤要充分。 4.4.要设阴性和阳性对照。要设阴性和阳性对照。 5.5.显色注意底物要适量、时间要严格控制。显色注意底物要适量、时间要严格控制。 免疫组化及特殊染色 6.6.消除内源性