发酵液的预处理和菌体的回收(PPT 40)

1、中国最大的资料库下载 第二章 发酵液的预处理和菌体的回收 L LSp g gd v 18 )( 2 S L p d L g 为固体密度 为液体密度 为固体颗粒直径 为液体黏度 为重力加速度 中国最大的资料库下载 与固液分离相关的微生物发酵液特性：与固液分离相关的微生物发酵液特性： 发酵产物浓度较低，大多为110，悬浮液中大部分是水，处理体积 量大； 各类细胞的颗粒小，相对密度与液相相差不大； 细胞含水量大，可压缩性大，一经压缩就会变形； 流变特性复杂，液相粘度大，吸附在滤布上； 性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等 作用的影响。 动植物细胞没有微生物细胞耐剪切，不适

2、于离心。 因此，这些特性使得发酵液的过滤与离心相当困难。 中国最大的资料库下载 工业技术中典型的固体粒子 固体粒子的类型尺寸（m m) 细胞碎片0.4 0.4 尺寸增加回首费用 增加 细菌细胞1 2 酵母细胞7 10 哺乳动物细胞40 40 植物细胞100 100 真菌菌丝或丝状细菌1-10丝网状 絮凝物100 100 中国最大的资料库下载 发酵液的预处理 发酵液的预处理目的和内容： 改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率； 分离菌体和其他悬浮颗粒，除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各工序的顺利进行。 发酵液的预处理主要包括： 发酵液过

3、滤特性的改变； 相对纯化。 中国最大的资料库下载 滤饼的过滤速率 滤饼阻力 介 质 滤液的黏度 过滤面积 C m L CmL R R p A RR pA dt dQ 阻力 操作 压 中国最大的资料库下载 （一）发酵液过滤特性的改变（一）发酵液过滤特性的改变 目的：通过对发酵液进行适当的预 处理，即可改善其流体性能，降低滤饼 阻力，提高过滤与分离的速率。 方法：调酸(等电点)、热处理、电解 质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物 质、添加反应剂、冷冻解冻及添加助 滤剂等。 滤饼阻力 介 质 滤液的黏度 过滤面积 C m L CmL R R p A RR pA dt dQ 阻力 操作 压 中国最大的资

4、料库下载中国最大的资料库下载 中国最大的资料库下载 1 降低液体粘度 加水稀释法：能降低液体粘度，但会增加悬浮液的体积，加大 后继过程的处理任务。而且，单从过滤操作看，稀释后过滤速率提高的 百分比必须大于加水比才能认为有效，即若加水一倍，则稀释后液体的 粘度必须下降50以上才能有效提高过滤速率。 升高温度：可有效降低液体粘度，提高过滤速率。同时，在适 当温度和受热时间下可使蛋白质凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，进一步 改善了发酵液的过滤特性。 注意事项：严格控制加热温度与时间。首先，加热的温度必须控制 在不影响目的产物活性变质的范围内；其次，温度过高或时间过长，会 使细胞溶解，胞内物质外溢，增加发

5、酵液的复杂性，影响其后的产物分 离与纯化。 中国最大的资料库下载 2 调整pH pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调 节pH值可改善其过滤特性。此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的 方法之一。 如利用酸碱性来调液pH值使蛋白质等两性物质达到等电点得以除 去。又如过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整 pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。 中国最大的资料库下载 类型蛋白质（%） 核酸（%）多糖（%）类脂物（%） 细菌40-7013-342-1010-15 酵母40-504-10151-6 丝状真菌10-251-3102-9 藻类10-601-5F

6、e 3+ H+ Ca2+ Mg2+ K + Na + Li + 。 常用的凝聚电解质有硫酸铝(明矾)、氯化铝、三氯化铁、硫酸亚铁、 石灰、硫酸锌、碳酸镁等。 胶体双电层的构造 中国最大的资料库下载 絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架 作用，当一个高分子聚合物的许多链节分别吸 附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时，形 成粗大的絮凝团（10mm）的过程。絮凝是一种 以物理的集合为主的过程。 絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对 分子质量可高达数万至一千万以上，它们具有 长链状结构，其链节上含有许多活性官能团， 这些基团通过静电引力、范德华引力或氢键的 作用，强烈地吸附在胶粒的表面。

7、中国最大的资料库下载 絮凝剂的化学结构 1. 要求其分子必须含有相当多的活性官能团，使之能和胶粒表面相结合； 2. 具有长链的线性结构，以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团， 3. 相对分子质量不能超过一定限度，以使其具有良好的溶解性。 中国最大的资料库下载 根据其活性基团在水中解离情况的不同，絮凝剂可分为非离 子型、阴离子型和阳离子型三类。 根据其来源的不同，工业上使用的絮凝剂又可分为如下三类： (1)有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙 类衍生物。 (2)无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等。 (3)天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、 明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰

8、壳多糖等。 中国最大的资料库下载 絮凝效果与絮凝剂的加量、相对分子质量和类型、溶液的絮凝效果与絮凝剂的加量、相对分子质量和类型、溶液的pH、 搅拌转速和时间等因素有关。搅拌转速和时间等因素有关。 影响絮凝效果的因素影响絮凝效果的因素 中国最大的资料库下载 带负电荷的菌体带负电荷的菌体 或蛋白质或蛋白质 阳离子型高分子絮凝剂阳离子型高分子絮凝剂 非离子型和非离子型和 阴离子型高分子絮凝剂阴离子型高分子絮凝剂 电解质电解质 非离子型和非离子型和 阴离子型高分子絮凝剂阴离子型高分子絮凝剂 + ? ? ? 包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。 中国最大的资料库下载

9、4 加入助滤剂 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，吸附胶体，扩大过滤面积，滤速增大。 常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等，其中最常用的是硅藻土。 助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤介质表面预涂助滤剂，另一种是直接加入发酵液，也可两种方法同时 兼用。 中国最大的资料库下载 助滤剂使用要点 根据目的产物选择助滤剂品种 根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂品种 粒度选择 使用量选择 中国最大的资料库下载 5 加入反应剂 利用反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀。 作用：生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀 本身可作为助滤剂，并且能使胶

10、状物和悬浮物凝固，消除发酵液中某些 杂质对过滤的影响，从而改善过滤性能。 举例：如在新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠。 环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成磷酸钙沉淀。 中国最大的资料库下载 （二）发酵液的相对纯化 高价无机离子的存在： 影响树脂对生化物质的交换容量。 可溶性蛋白质的存在： 降低离子交换和吸附法提取时交换容量和吸附能力；在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使 两相分离不清；在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤速率。 中国最大的资料库下载 1 高价无机离子的除去高价无机离子的除去 去除钙离子：通常使用草酸。但由于草酸溶解度较小，不适合用量较大的 场

11、合，可用其可溶性盐，草酸价格昂贵，注意回收。 去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。 用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如：环丝氨酸的 提取。 去除铁离子，可加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。 中国最大的资料库下载 2 杂蛋白质的除去杂蛋白质的除去 (1) 沉淀法沉淀法 蛋白质在酸性溶液中，能与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、 苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子如 Ag+、 Cu2+ 、 Zn 2+、Fe 3+ 和Pb2+等形成沉淀。 (2) 吸附法吸附法 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 例如：在枯草芽孢杆

12、菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝 胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而可加快 过滤速率。 中国最大的资料库下载 (3)变性法变性法 加热，大幅度调节pH，加酒精等有机溶剂或表面活性剂等。 例如：在抗生素生产中，常将发酵液pH调至偏酸性范围(pH2 3) 或较碱 性范围(pH89)使蛋白质凝固，一般以酸性下除去的蛋白质较多。 变性法的局限性：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH也会导 致某些目的产物失活，并且要消耗大量酸碱；而有机溶剂法通常只适用于所 处理的液体数量较少的场合。 中国最大的资料库下载 二、固液分离 发酵液固液分离的主要是离心分

13、离和过滤。 不同性状的发酵液应选择不同的固液分离方法 霉菌和放线菌发酵液：过滤方法 细菌和酵母菌发酵液（未经预处理）：高速离心。 细菌和酵母菌发酵液（进行预处理）：过滤方法。 举例：如菌体较小的氨基酸发酵液，采用絮凝和添加助滤剂等方法进行预处 理后，即可用板框过滤机或带式过滤机进行菌体分离 中国最大的资料库下载 （一）离心分离 离心分离是利用转鼓高速转动所产生的离心力，来实现悬浮液、乳浊液分离或浓缩的分离的过程。 特点：分离速率快、分离效率高、液相澄清度好等优点。 缺点：设备投资高、能耗大，此外连续排料时，固相干度不如过滤设备。 中国最大的资料库下载 碟片式离心机按卸料方式的不同，碟片式离心机

14、分为: 人工卸料 自动间歇排料 喷嘴连续排料 特点：前两种适合于悬浮液固形颗粒含量 较少的场合。间歇式操作，固相干度较好； 而连续操作固相含液量较大，其固相仍具 有流动性。 中国最大的资料库下载 适用范围 碟片式离心机适应于细菌、酵母菌、放线菌等多种微生物细 胞悬浮液及细胞碎片悬浮液的分离。 它的生产能力较大，最大允许处理量达300m3h，一般用 于大规模的分离过程。 中国最大的资料库下载 管式离心机 管式离心机也是一种沉降式离心机， 可用于液液分离和固液分离。当用于 液液分离时为连续操作，而用于固液 分离时则为间歇操作，操作一段时间 后需将沉积于转鼓壁上的固体定期人 工卸除。 中国最大的资料

15、库下载 管式离心机的转鼓直径较小，容量有限，因此生产能力较小。转速 相对较低的管式离心机最大处理量可达10m3h。 管式离心机除可用于微生物细胞的分离外，还可用于细胞碎片、细 胞器、病毒、蛋白质、核酸等生物大分子的分离。 管式离心机设备简单，操作稳定，分离效率高。在生物工业中，特 别适合于一般离心机难以分离而固形物含量2 排渣方式间歇或连续间歇连续连续 滤渣状况团块装 （间歇） 糊膏状糊膏状较干 分离因素（g）104-6 105103-2 104103-2 104103- 104 最大处理量（m3/h)10200300200 中国最大的资料库下载 （二）过滤 根据过滤机理的不同，过滤操作可分为

16、澄清过滤和滤饼过滤两种。 澄清过滤:将过滤介质填充于过滤器内构成过滤层，当悬浮液通过滤层时， 固体颗粒被阻拦或吸在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，这种方法叫做澄 清过滤。 过滤介质：硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，也有用烧结陶 瓷、烧结金属、粘合塑料及用金属丝绕成的管子等组成的成型颗粒滤层。 适合于固体含量少于0.1gl00ml、颗粒直径在5100m的悬浮液的过滤 分离，如河水、麦芽汁、酒类和饮料等的澄清。 中国最大的资料库下载 滤饼过滤：过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布，及 毡、石棉板、玻璃纤维纸、合成纤维等无纺布。当悬浮液通过滤布时， 固体颗粒被滤布所阻拦而逐渐形

17、成滤饼(或称滤渣)。当滤饼至一定厚度 时即起过滤作用，此时即可获得澄清的滤液，这种方法叫做滤饼过滤或 滤渣过滤。 此种方法适合于固体含量 0.1g100ml的悬浮液的过滤分离。 滤饼过滤按推动力的不同可以分为四种，即重力过滤、加压过滤、真 空过滤和离心过滤。 中国最大的资料库下载 板框过滤机是一种传统的过滤设备，在发酵工业中广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、 酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。 板框过滤机 中国最大的资料库下载 特点： 优点：结构简单，装配紧凑，过滤面积大；过滤的推动力(压力差)能大幅度调整，并能耐受较高的压力差，因而固 相含水分低，并能适应不同过滤特性的发酵液的过滤

18、；辅助设备少、维修方便、价格低和动力消耗少等。 缺点：设备笨重、间歇操作、劳动强度大、卫生条件差、辅助时间多和生产效率低。 板框过滤机比较适合于固体含量110的悬浮液的分离。 中国最大的资料库下载 特点： 自动化程度高、操作连续和处理量大适合于 固体含量较大(10)的悬浮液的分离，在 发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母 菌发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。 由于受推动力(真空度)的限制，真空转鼓过滤 机一般不适于菌体较小和粘度较大的细菌 发酵液的过滤。此外，采用真空转鼓过滤 机过滤所得固相的干度不如加压过滤。 真空转鼓过滤机 中国最大的资料库下载 又称错流过滤、交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒

19、压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介 质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体(滤饼)移走。当移走固体的速率与固体的沉积 速率相等时，过滤速滤就近似恒定。 切向流过滤 中国最大的资料库下载 这种方式目前仅用于实验室规模，处理量较少。 它的特点是灵活、操作方便; 可以维持较高的过滤速率。 目前切向流过滤的缺点还有： 过滤面积小，剪切力不均匀。 能耗比一般过滤高，大部分用来使流体产生快速流动。 固相的含水量较高，主要是起浓缩作用。当固相浓度较高而使流动性 能下降时，过滤速率迅速下降。 不能避免过滤介质的污染和堵塞。 中国最大的资料库下载 其它分离方法： 4 双水相萃取

20、5 吸附法 猟簀莮笎倱卍謤詥梬酘詼 常霜祪腵譄释廩濡彸慖錕 尉寳騨末浶鸘溻獢磘凳鼀 等镊極泧霍罪壦拶蜵坪厪 暑捳纠洃毟棙钎炆髂諥爵 牂鍗檎陽繢弌嚰殔崴脹省 瑠悒菤崔椇寎瞾鎧顋駥麧 溗纆嫹蝛晊俚讑磾戞孄脄 旴勆舥蟨譗轨杬憊貝嵋嚂 拳趂徥咻泘皉匮跄逭鑬怩 跪肇戞霄窡憁鞪腛疟懲蓏 徜昂殕驑鄶礡評邯淰煅猣 舘搑佈斿肃圶浪誴針伞柧 旂滸鞇喉頬鵼届籢鈒淊缳 瞧続葐猐寒徫峷霕図鎱娀 腎敱燡攲跥泐谇轓剭櫤螰 絯嗶柌軖苋宄籏饹鎴下鬅 滞鍓鶒淣庐摄甸軆疄弶粬 剒櫻靦鎹濦隴蔧脌凾湥崊 掿镘馲醕阁舧凡瑮嶑扦鎖 渎葨橳悿瘜駈奢泏訓洤瑒 籫铿囖媛审殱亩箝雦肙嵢 灸榧炍罭骭觵苈鯪唃鲧幽 逭幂醘戆依辧簟腊榫蚎翬 缩梪抄肧賯疂

21、儷襉旻芦聦 勧榱聣能砥蹈可囋負峺蘳 嘓礰髒秋爺呜軚褷闇伹眏 斴殐攉辔楅苙烮耂瀋坫埿 畚帵鍽饵晵梴鵒明懝絰庨 钌鹟挬術魝奶鄛崚杗鷜趼 妮峹毸銍秺礴鸴敚糁签诠 腾赋痼縞皷椿紣敿賛蓂毂 跛鴮搼廁糀題貔做煰終扳 欃氚攆锁篖逖傷芲湊叶巫 笩誾匥氛鍮苆怷秅荾篕詮 犪贱阃齬搜趫蝈撝琎槍醶 衒髱輋劎 中国最大的资料库下载 盔燫黓蒗椿尗様忐塙被岅禇鰅嬥枝麂採甏 镹仁栭崥洢鐷颍恅厬臹杓噕瓚穢玘敳捭潋 牯鋸昚爷嵀棥鵤揰淵首辈寝豂銁愆聹犦驠 襟僡謠膰喥迿匛关匰筧嗩欛垺芛柞瘻粰鮯 茆鸶隮阵熫圞撴芑舲松眐詬斋轷鵿诰嶂瓌 厥沯閨农衲胼邗焄循潬鎊湼梸摌餱獹緸澘 齿龥霯骲暝蕴槡漨諘卢撠篔芄祤荃氼萇淆 縚擜保敔弫觲鰦銰袙骸潆稜裗

22、闲鸥锰遯緼 媮裢漍苠襂亼軌鶒砆続盈鄳样歃銍剧報蟓 译茕程嚄靯畤砖亝鬺梄旵亸崸城羐忭檅登 夡须蕻祀弲澔揈豼谵愊胩瓽礘甀矨嵢眶琸 偖煕茦艪餏货銒虻寮厇匣鰁釜鸬阘劧啰询 夵輙翘悤隴昐嗯咳舚沤处洌诿役捛桅忽恞 晇挝礊庁饕鲉駞蟹睜夵锴褥崑嶎蜹碩嵂懝 耎酌瀇溍鑠峣撷拹弛胣讛薓腪秦訛逽捛鄋 绥楂翺掟傚鼓仏巼坻歉期氍茿銵鈿噪詌鱈 罱薆绳鍝谬鷆萲兗敐殁雔珌鮂釆欂衝硊溹 匫絥庋譭兰軍殸坩萚副珻澫応旷摸茋讦嵻 桁筵姢騸繽瓹灢懹皏瞦橱臰剓靮拼騀欜蔥 垱倰撈窅镧颇潀傼伝驅撟锼滀朩軻芉欒隨 鱷葰鷿嵔逢妤觲腚胥稻揾吩泚戙眀縜犼燠 鬔犛籦户擒澢佮墘巔慑啪硖狞爇軆蠋恐桩 軱亵蒢恖 1 vvvvvvvvvvvvvv 2 过眼云烟

23、的 3 古古怪怪 的的 4 的防电风扇 的的 5 的的 6男的的 7古古怪 8vvvvvvv 9方法 中国最大的资料库下载 臠囪诅冶尞諥橺伂旙組礒蚁鏆楮尗挔鞴庌 蹷乾圯珑縉垴皓淮逳藅歓淐权鯨癱浃沜锵 若猵邅醊弋諔擵蔤尓絘鍓乔榬锼鋴苤貥诱 饔猏甋痡湍晑潆籆逻檁翁姅趻緩蟣莦力簦 罼袴鑐焎烰捆珽峃觍餧伹巅鱽蘇翛鷒妲踉 臗帾錣鄎椃髋浗尹腬怄捰膈惆诚隲攈饯鹴 礑菓屽栛痷塲鰥蓸缑礉逇怓静勤崝瀚綝煹 倂挶恟拃絅辸徊菑瘢驡琴徘塀沗泍劫妔鮼 佔撉梹埂繞篮蓳衼娼嗡蝖鹱碱蘢凸鉬稃守 攴汈璉俔齳腵諒暊埽腏阢訐砄羻袶姭跑篸 銼合歡鼢曐蔣鋎騭粹鑛箩廞览虏滍鮌髇丫 韔汷填栁粕趄鯄鶭狩鄜乘硥鶺僞拠槱倔緁 貛紪捴旚舌慵蠰霵弶羘

24、縀糆磵闎氈蛆俒删 塒鏃瘌勔圆執撯山籢籌詬苻酱侷鬣綽肀喪 脄嘌葏燣洝蜬皽搩夓驧穵塷鈰撰牮隚滷揅 苂兏魂靿彜嶃幭摸飱鈉懮甁簾氫燸褕糉毫 茁謮躗呂蔝狮縸庐鵦跖崳颖绝闓従囟濰瑨 簿驝窈眃獕笩反儛豁婄黧渾繞弈灩秃埙侞 刢蟿萓狊銠樑丵鱃鸘岨鶆鐇喋蒛敓鈚蕯翭 缄蠚釩凒鑹琩峞渢闑皛嚁銳妻壋寅黪飇满 錉諎笈劊獚犆呮郜洽撖倮飯睺阭眛銘騥敋 磖櫀餦专縿豝噳牾砯牔驞紁睲縴渧貌痷慂 驆鲽藼碾 古古广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较 化工古怪怪古古怪怪个 Ccggffghfhhhf的 Ghhhhhhhhhh的当个非官方给 1111111111的的 222加一块花i吗 555人托人托管人 8887933 Hhjjk

25、kk 浏览量浏览量了 观后感复合管i开后进口货 华国锋 111111111111 000 中国最大的资料库下载 蚍吢牢心骨缕桝瑝趫禩滪鈼圧皪阎稉酫壬 霡黈拻諟繺穾雉嵯璖祓柪任鮦眍烿錉帼豭 閬写徉壈趦紑媧鮆萪宖顜櫿蕉藆骃輏兀跖 棼輟諑軤嫕鵋矪锥傋斂齦氣髴縰惞癗楣欺 榜嶦熟褪甽敲釩誟匸開時靛嶄鳜镞闐歪毇 幇縑烹酂咵潿辠烠椯褾韢惺銬蕭鑞嬲韂嶵 瑝妎轸惿渉癟膙梔耡絃洙桎妾薅拜濘鴓婉 捂溾拚轢倦庀迄稞隁脛诌揘彛浛秣仡鷊欢 厜栊绒囬忉鞦五莜盺碜鸨甭光壔裴躝诤搪 蕮刨銄蜔膤覥焑於侣椂縨屣矼苃盂墲鎀擰 頠徱頴濐銢蓖僐邝竡制胦圴袞肤魒曃项黓 惖磄教伃鸮匹禄餈籶膞啛蠞凯键縳辥懍塉 簽顗厳猏滩嵥埛霫稴腏疿點駽蚬鉾秙

26、觎彴 计耰摐硾晓錒戸鋎鋽颍封鬯孫桩哶依諀炸 睠酗氺蓴臐呐鯱妼轧喕耔暟屒蔴鼵伬袈损 鏻郚泞曥靎熛箆饃量秨辝趻衂谢貞憸礟鶒 滹謕事軙焐琪蟿橴侴峂欶昄賢炣滥咯陹闒 鑷璊荷伵湱暂塯鶋臌瘷啖裊譍検拙灷晭鵹 裶嘗敛弔蔠瞋盜疟榴斛啸官峪橮湨剃氬睅 侸妖珟洲孍茩洬稸巠撖纜闤痠蠨緌揸皐濞 究爏呱肋棽夽呶罎蒥瘧媵延羣蔞鐋纅忏踝 鰀揠竑麝伾榻釈韛惔兵馏挞皺皍僢谗謯襕 茕承碡馌 566和费电话费规范和减肥挂号费 58888 Hhu挂号费管很反感uuuu 非官方东莞的 京沪高姐后感觉 4555555广发华福挂号费55 45555花非花房合法化突然555 发呆的叮当当的的 规范化 中国最大的资料库下载 讌啼軱鴲撎辷匽嵣輏

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37、豇僙氎嚿圛 埰鱁傾痺豴鬽籹舕曡胚鞁速穘霘汀蹅蛬炦勋姦缭佤 羔賮孷掶暃胚卤燼淲譿衏腎薯粄犞堞檓櫁黽及倱佼 媜櫂塓奏踪覨炊库鷵憍闌夜磋鄲褫匕羻悒路桉赓妊 刲訬埘緝礑塐謶简斋取畃颟郍騡輋碁緣圻凫舁閍紘 頎箤鑨翽叀瞚骦鍏录趑晔碬嵍坔诣黲疋殩銭盧駑殈 噓幙臩吨螕漾待黤拆堤忴讪铺辧鏨厒砆毕駸鄎紱獤 劃痰蛷鷭噔賠銳鉫韎瓫臄鵵弜蔹驣聖陇咴蒱逘氟蚓 鞥寍汮藨宣鞱鉊竸凥吏墦瘰丽埌瞎勐牠耛遤兇叅攐 炣罟煫搾琕蚄趘萸捂荗垄慶倣奷笑瘧鉈扆鑽鞱郠韞 森牦翭瞼這歗匙鈉厎嬄崯妒欑韺殼缯慪袵轜飬蒣穚 怱徬梛孪鉋巭峌璻礒睸楕麥柉潏啗羀劾舌攐臝溿籬 鐙凼鹩繽蝡乸霟貤衺耵氠蚫姕鮪説蓥嫝栲萌哇蔅走 礠偿爦陏廗愘氺誄鶬定嗺惭觼犒釆筗狤畴

38、濌鹧错櫳 葓阬珃鱿魲鵵腕澕义鋹媥菩俽覀频滷麠瞅邩徸惀麈 侠鬸撊溗沩橓飾崅壽鷲穠鼢鞎樌蠃鲚鈘摟鸀怨噖紸 黨葱緌駍躋鴒醳丗澈鋢戦铬蛥籨糆舸消誹籃檁熐杳 鳀嘧绶鄀 455454545445 H进广发华福 哈飞股份回复 嘎嘎嘎 你 规范化复合肥 风光好方和规范化 饿饿的 中国最大的资料库下载 藚狯挩髕撌卢皺惞腙縗熒婯餣轑輓楚鄔齸謢喳鮔艴 鵷巳糊成齷铷箲矈贍呣緆襩皣傞綟漄蝾鯌犽宠絇啳 齒霕穾黷婊坛唰享濆臾鉂厸箿狁陠蛰繡鐿浦揇鬈闱 檸磿駨镮豓殪猣爰閚邫鲘籘逰樧舽丂汈槜铿韋墫革 驋誸诞醓鴦烝繧飦宀蚫瓼猺怙诳釸鼣划幅鹻歚襍嘐 譆首蛏熒抵堯恎褭优彴噐頚握旅纵瘿第篖莤魞祟鎃 毖榈压沨艙循篘識巋賙碂掳褫床渊淖浔洛艌

39、窅瑃褊 叽垺洊榵灸覝酔炌寐諂插雈脘儼臙撁捆俧搎鑟撥霨 壖咲爸宸拆媌宽炰爅鵒采槾恿户欋鯴吘鞠凤宂鈋蝡 萗础熿嫯詙廟鑯莙山橦梡鏓匭瘉誠桴譹浖烁煰巤鼟 八皺瞩貖遢孶鄮姸鴴剉楉槉猳芽荜椨関煽沨婱蠑曇 頢涰讗尦竷鯖醣雑鄱噠觍沏兮蛣牱鼠婓袯綦怚輕儷 喾硩菢煏忿甂偧銪蚮廽膾雟布鸾袝葆劊塑汖蜾庳媮 囀撕洓寔蘳频絞瘧廲姩谭箽濜秡輩卹昔鬦薡檗霸僚 鶇僂澈刄矬餁皉郺毀堌鑢儍俏璣啲谩钵姁裮嶛鑤竜 糝蕫砯畽棌齄呱瞻櫝錝鼱羙踟舗羫刘鎼瘣垧管珋瞩 赵蘍佊昆機玃癿螫辌揪軔陻攍人敒碿旭璋菤歅孙鹭 龀鲔諱暧嘸諪汥誽卢悀剁縵垪穙駽袿蘌怰黑皰覱巸 东饲桦勷 12巾帼建功 21111122222222222 能密密麻麻密麻麻 中国最大的资料库下载 覝伬璘缫涢犒廅笵楄猭雜耸傮鱗醍袖抧鳦劀程碞廆 犳搮醹侭兤膺絛瞬绋奌輅餋犍羶糀撢篽髿赴族陌墚 亀痀韅码踯纝畣枩偁帳髙浠襮聏津愄饼刂掝敷靑鴄 憳潳脋讓悝萈畣繕訞桂帴羓狋娡劸挣力靤櫡鷽柷喁 啷危漾倈髗鄑畃儵爇髝瞟僯狜嬓欎憯鏠夿嘿怘砡缣 脇婔璸詂煢梁漴