DNA的琼脂糖凝胶电泳.

1、实验十DNA的琼脂糖凝胶电泳实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方 法。实验原理 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷, 在电场中向阳极移动。 DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了 电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分/ 町片段的和对分子质量不同，移动速度也不同， 所以町将和对分子质量不同或构象不同的DNA分 离。0.61.斗琼脂糖凝胶适用于3*W611*106和对分子 质量的DNA分了或片段的分离，所需DNA样品量 为 0.5 l.Oug。琼脂糖凝胶电砚勺QNTti寸柑谢tNn处染色O漠化乙噪分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基 之间，形成一种荧光络合物。在2

2、54nm波长紫外 光照射下，呈现橙黄色的荧光。用浪化乙唳检测 DNA,町检出10進以上的DNA含量。、试剂与器材 1、6X上样缓冲液：含0.25%澳酚蓝、0.25%二甲苯 青、30%廿油的TBE缓冲液。 2、5XTBE 电泳 缓冲液（0.45mol/L Tns-硼酸、 O.Olmol/L EDTA,PK=8.3）f： 称取54gTns碱，27.5g硼 酸，3.7g EDTA-Na2溶于SOOnil蒸憾水中，定容至 1000ml使用时用蒸傳水稀释10倍成为0.5XTBE电泳缓冲液。 3、琼脂糖中，避免温室保存。 4、澳化乙锭（EB） lOmg/mL:取EB 0.10g, 完全溶解于WmL水 5、

3、DNA分子量标准品（DN人M竝ker）。 6、DNA样品液三、操作方法琼脂糖胶液的制备：称取0.6g琼脂糖，置于锥形瓶 中,njA60ml0.5XTBE电冰缓冲液，置于彳肢波炉或 水浴中加热融化，取出摇匀即为1%琼脂糖凝胶液。 待凝胶液冷却却至6(rC后加入漠化乙锭3xL,使其 终浓度为0.5jig/mLo胶板的制备在制胶槽内插入样品梳，将凝胶液倒入制 胶杷山主胶擬同丿二,取山梳jSJ 泌1甥 放入电泳槽内，力n入0.5XTBE电泳缓7缈 至电泳槽中，使其没过凝胶表面12min, 排除加样孔中的气泡。存加样用移液器将DNA样品液51J L与6X上样缓冲液 Ip L混匀后加入加样孔，记录点样顺序

4、。其屮一 个 加祥 孔中加入DNA分了量标准品电泳加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另 一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开 奸胶前可丿IJ略高电压厂防王样胡 扩散。样品进胶后，应控制电压降不岛丁5V/ cm（电压值V/电泳板两极之间距离比）。当染料 条带移动到距离凝胶前沿约Icin时，停止电泳。观察与拍照小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗 胶表面的漠化乙锭溶液，然后再将胶板推至预先 浸湿并铺总紫外灯孃台士的玻璃纸估 Tf波长 254nm紫外灯卜进行观察。DNA存在的位置乜现 橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带.荧光在 牛6小时后减弱，因此，初步观察肩，应丫即拍照 记录下电泳图谱.

5、观察时应戴上防护眼镜或育机 玻璃防护面罩，避免紫外光对眼睛的伤害。拍照时，照相机加上近摄圈和红色滤光 铺头，用全色胶卷。56光圈，曝光时间 根据条辎酗 强弱矽祕择i)-6()s O 将电泳图谱底片适当放大为照片。四、注意事项漠乙锭是DNA诱变剂，配制利使用EB染色液时, 应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在桌而或地 血厂L。凡是沾污过炖锭的须经 专门处理后，才能进行清洗或弃去。为使DNA完金酶解，需加入适量、足够的酶。太 少反应不完全，太多则很费。III于每次购进的IW 浓度不可能相同，因此酶和DN A加入的体积不能 固定，合适的酶量应该通过预试验來定。-DNA酶解过程屮，使川的器具都应丁净，并

6、经消 毒。配制试剂需用灭菌的双蒸水还要防止限制性 内切猶被污染。加样量的多少决定于加样槽最大容积。可以采用 人小不同样品糟模板以形成容积不同的加样槽。加人样品的体积丿卫略少于加样槽容积。为此，对 于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩。五、思考题-(1)琼脂糖与琼脂有什么不同？本次实验为何选 琼脂糖作为世泳介质 (2) I:样缓冲液由哪些成分组成？各冇何 作用？ (3)常用的DM琼脂糖7疑胶电泳缓冲液冇 哪些？为何在这些电泳缓冲液中耍加入 EDTA?琼脂和琼脂糖琼脂是由琼脂糖和琼脂果胶组成的。琼脂糖是线性的多 聚物，基木结构是1,3连结的pD半乳咲喃糖和1,4连结的 3,6一脱水*1半乳咲喃

7、糖。琼脂果胶是由许多更小的分子 组成的异质混合物。它们的结构相似，但带硫酸根和竣 基组分，斗铤胶能丿J差-琼脂糖具有亲水性，并几乎完全不存在带电基团，对敏 感的生物大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性載 体。在琼脂糖制备过程屮需要把琼脂果胶尽址去除，否 则琼脂糖令可能存在极微量硫酸根和内酮酸取代电离基 团，就会造成电内渗(EEO),电内渗对质点的移动产 生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含駅比鮫低，通常在 0.2%以下，电内渗比较小，通常彳E().13以卜。这也就是琼 脂糖比琼脂贵那么多的原W 了。上样缓冲液含0.25 %漠酚蓝：指示剂 0.25%二甲苯青；示踪染料 30%廿油的TBE缓冲液：增

8、加密度电泳缓冲液电泳缓冲液在电泳过程中的一个作用是维 持合适的pH。电泳时正极与负极都会发牛 电解反竝日及发生的是氧化反应七51- 4e-21120+02),负极发生的是还原反应( 4H+4e-2H2),长时间的电泳将使止极变 酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较 强的缓冲能力，是溶液两极的pll保持某本 不变。电泳缓冲液的另一个作用是使溶液 具冇一定的导电性，以利d-DNA分子的迁 移， TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋 在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中 电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量 ），丄144链线即在奥屮的辽移率较其他两 种缓冲液快约10%,电泳大于

9、13kb的片段时用 T人E缓冲液将取得更好的分离效果，此外，冋收 DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE 的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不 可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交 换EDTA电泳缓冲液还有一个组分是EDTA,加入浓度为l-2mmol/L,目的是螯合Mg2+等离子,防辻也泳旳謫C活dZWrrH%卜还时防上 Mg2+离子与核酸生成沉淀。常用电泳缓冲液Tg硼酸(TBE)使用液：0.5X： 0.045mol/L Tns硼酸，dOOlmol/L E DTA 储心液：5X : 5/|g ns妆成，27.5gffl四込 20mi (J.Smol/J. EDTA (pH8.0)JTm-乙酸(TAE)便川液：IX： 0.04mol/LTiiA乙酸，O.OOlmol/L EDTA 储存液：SOX： 242g Tris碱，57.1ml冰乙酸，l()()ml0.5mol/L EDTA (pH&O)tns-ZiM(tae1 Xi 0 tWmoi/l 怕s乙敢0.00lmoi/l edtatris-瑚毁(lpe1x.0.09moW tris-iiSB0 002moLn edta0 5x0 O45moi/i