实验动物细菌鉴别用血清的制备及标化

1、实验动物细菌鉴别用血清的制备及标化第23卷第3期2006年9月实验动物科学与管理lab0rat0ryanimalscienceandmanagementvo1.23no.3september2006技术?方法易,护,铲,护,护,护实验动物细菌鉴别用血清的制备及标化高正琴王春玲邢进贺争鸣邢瑞昌(中国药品生物制品检定所,国家实验动物微生物,遗传质量检测中心,北京100050)摘要:目的制备并标化l6种实验动物相关病原菌鉴别诊断血清.方法将l6种标准菌株灭活,制成适宜浓度的免疫用细菌菌液,分别经耳缘静脉和背部皮下多点注射32只spf家兔,获得相应抗血清,经吸收去除非特异性凝集,制成特异性诊断血清.结

2、果以玻片法和定量凝集法进行敏感性及特异性试验,结果显示抗血清只与相应的免疫用细菌形成特异性的凝集颗粒,抗血清凝集效价l:l280.结论所制备的抗血清特异性强,效价高,为实验动物细菌学检测提供了有效的血清学鉴别诊断试剂.关键词:实验动物;细菌;诊断血清中图分类号:q93.337文献标识码:b文章编号:10066179(2006)03.0054.03随着生命科学的发展,作为活的试剂的实验动物的质量就显得越来越重要.采用科学有效的方法,对实验动物本身所携带的致病菌及饲料,垫料,饲养环境中潜在的病原菌进行监测,是实验动物质量保障体系中不可缺少的一部分.目前,对于实验动物相关致病菌的检测主要采用传统的细

3、菌学分离培养及生化鉴定的方法,给临床大量样本的检验带来繁重的工作,故迫切需要细菌鉴别用诊断血清对批量样品进行初步筛查,并为细菌学分离培养及生化鉴定提供佐证.为此,本研究选用清洁级家兔,采用合理可靠的免疫方法,制备了l6种实验动物相关致病菌的抗血清,并在实际检测中进行了初步应用,取得了良好的效果.1材料和方法1.1菌种乙型溶血性链球菌(b.hemolyticstreptococcus),单核细胞增生性李斯特杆菌(listeriamonocytogenes),支气管鲍特杆菌(bordetellabronchiseptica),肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae),嗜肺巴斯德

4、杆菌(pasteurellapneumotropica),多杀巴斯德杆菌(pasteurellamonocytogenes),鼠棒状杆菌(corynebacteriumkutschi),肺炎支原体(myoplasmaspp.),肺炎克雷伯杆菌(klebsiellapneumoniae),沙门氏菌(salmonellaspp.),假结核耶尔森菌(yersiniapseudotuberculosis),小肠结肠炎耶尔森菌(yersiniaenterocolitica),铜绿假单胞杆菌(pseudomonoasaeruginosa),金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus),大肠埃

5、希菌(o115a,c,k(b)(escherichiacoli0115a,c,k(b)和志贺氏菌(shigellasp.)共l6个标准菌株,由中国医学细菌保藏管理中心提供.1.2实验动物32只spf家兔(22.5kg/只)由本所动物中心提供(生产许可证号:scxk(京)20050004),饲养在本所动物实验室(使用许可证号:syxk(京)20010002).1.3培养基及试剂普通肉汤,普通琼脂斜面,血琼脂斜面,bap,dhl,sp,nac等培养基由本所培养基室提供;弗氏完全佐剂为美国sigma公司产品.1.4免疫抗原的制备将菌种复苏,分别接种于bap,dhl,sp,nac等适宜培养基中,观察各

6、菌株的典型培养特性和染色后菌体特征.经纯菌检查合格后,将菌株接种普通肉汤培养基,置37培养1824h,制成预定浓度的菌液.采用比浊法和紫外分光光度法确定其终浓度:呼吸道菌的浓度为1.05.0l/ml;肠道菌的浓收稿日期:2005.11-ol作者简介:高正琴(1976一),女,助理研究员,硕士.研究方向:微生物学和免疫学.第3期高正琴等:实验动物细菌鉴别用血清的制备及标化?55?度为8.011亿/ml.按菌液量的0.3%加入甲醛溶液,置37灭活1824h.其中,沙门氏菌,大肠埃希菌(0115a,c,k(b),志贺氏菌,先经100c水浴2.5h,后再加0.3%甲醛溶液置37灭活1824h.然后,接

7、种普通琼脂斜面,血琼脂斜面,37培养2448h后确证无活菌生长.免疫用细菌经镜检,无菌试验检定合格后保存于4c.1.5免疫血清的制备将标准菌株灭活后制成预定浓度的菌液免疫spf家兔.其中,肠道菌直接经耳缘静脉注射家兔;呼吸道菌先以等量弗氏完全佐剂混匀后,再经背部皮下多点注射家兔.每种细菌抗原免疫2只家兔,每只家兔免疫5次,第1,2,3,4,5针注射剂量分别为0.5ml,1.0ml,2.0ml,2.5ml,3.0ml,每两针间均间隔3d.第5针注射后6d试血,采取免疫用细菌测定血清凝集效价,使其符合预定的要求,即为试血合格;若血清凝集效价达不到预定的要求,则加强免疫1次,重复第5针注射的剂量:若

8、血清效价仍不合格,则废弃该家兔.试血合格的家兔即可经颈总动脉放血,将收获的全血于室温静置过夜后,2000r/min离心10min,分离血清.所制备的抗血清,再用相关细菌进行吸收,吸收完全后,加入硫柳汞溶液使其终浓度为0.01%,冷冻保存.1.6敏感性及特异性试验以定量凝集法测定抗血清的效价,以玻片凝集法测定抗血清对各菌株的凝集情况,判定抗血清的特异性.1.7实际应用用所制备的抗血清对本实验室分离保存的嗜肺巴斯德杆菌,鼠棒状杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞杆菌等地方分离菌株进行了血清学鉴别诊断.2结果2.1特异性试验抗血清与免疫用细菌菌种在1min内出现明显凝集(强度达+以上),与不含有相应抗原

9、的免疫用细菌菌种至少在3min内不出现凝集.2.2敏感性试验将抗血清进行2倍比系列稀释后与一定浓度的免疫用细菌菌液混合,置37clc1824h,以肉眼能清晰见到的凝集反应(+)的最高稀释度为血清效价,结果所制备的血清凝集效价均在1:1280以上.2.3实际应用将所制备的抗血清稀释后,采用玻片法,与本实验室保存的嗜肺巴斯德杆菌,鼠棒状杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞杆菌分离菌株进行血清凝集试验.结果在3060s内,所制备的抗血清与含有相应抗原的分离菌株产生明显的凝集反应,而与不含有相应抗原的分离株在35min内未发生凝集反应,这与上述分离菌株细菌学分离培养及生化鉴定的结果相一致,血清学鉴别诊断的

10、结果进一步验证了细菌生化鉴定结果的可靠性,同时,生化鉴定结果的可靠性也证实所制备抗血清良好的特异性.3讨论目前,对于实验动物相关致病菌的检测仍采用常规细菌学检测的方法,通过细菌的分离,培养和生化鉴定来判定结果,操作繁琐,耗时费力.国家标准中虽有相关细菌的血清学诊断方法的描述,但实际检测时却因无法提供相关细菌鉴别用诊断血清(不配套或没有),而使检测工作变得繁重,给诊断带来困难,尤其体现在批量临床样本的检测中.以前,本实验室也曾多次制备过实验动物相关细菌检测用血清,但均为1种或几种抗血清的制备,而本文报道的是16种抗血清的制备及标化.在选用家兔制备免疫血清时,国内一般选用的是普通级家兔.由于普通级

11、家兔本身所携带的病原微生物一般不太清楚,收获的血清中可能含有动物自身携带病原菌激发机体产生的抗体,易发生交叉反应,影响所制备血清的特异性.本试验选用的32只家兔均为spf级,整个免疫过程中动物饲养在屏障环境内,这为所制备抗血清的特异性,敏感性提供了可靠的质量保障;同时,选用家兔体型适中,便于饲养,血量也较大,免疫1次,可以使用较长时间,避免了使用小动物(如小鼠)获得血量少而需要反复免疫的操作繁琐.在制定免疫程序时,我们充分考虑了注射部位,针次,剂量及间隔时间等多方面的因素,结合以往制备血清的经验,做了预试验.最终选用耳缘静脉注射法(肠道菌不加佐剂)和背部皮下多点注射法(呼吸道菌加佐剂),每只家

12、兔免疫5次后试血,效价未达预定标准者再加强免疫1次.由于初次免疫时抗体生成速度慢,效价低,维持时间短,通过再次免疫后,抗体的生成速度才会加快,效价升高,维持时?56?实验动物科学与管理23卷间长,最后的加强免疫又进一步保证了高效价抗体的产生;同时,佐剂的正确使用,又增强了免疫的效果,也是保证高效价抗体产生的原因之一.此外,我们还将本研究制备的抗血清在实际检测中进行了初步应用,显示出良好的特异性和敏感性,极大地方便了批量临床样品的快速检测,为细菌学诊断提供了系列化的诊断试剂,为相关单位(特别是开展细菌检测工作不久,或作生化鉴定有一定困难的实验室)细菌鉴定提供了非常有用的试剂.参考文献1李厚达.实

13、验动物学.北京:中国农业出版社,2003.56.2陈天寿.微生物培养基的制造与应用.北京:中国农业出版社,1995.179184.3韩文瑜,何昭阳,刘玉斌.病原细菌检验技术.吉林:吉林科学技术出版社.1992.2551.4中国生物制品标准化委员会.生物制品规程2000版.北京:化学工业出版社.2000.476496.preparationandstandardizationofdiagnosticserumfordetectingpathogenicbacteriainlaboratoryanimalsgaozhengqin,wangchunling,xingjin,hezhengming,x

14、ingruichang(nationalir*tituteforthecontrolofpharmaceuticalandbiologicalproducts,nationalcenterformicrobiologicalandgeneticmonitoringoflaboratoryanimals,beijing100050,china)abstract:objectivetoprepareandstandardizediagnosticserumwhichcanbeusedtodetectpathogenicbacteriainlaboratoryanimals.methodsthirt

15、ytwospfrabbitswereimmunizedwithsixteenreferencestrainsthroughintravenousandsubcutaneousinjections.a1lrabbitswereimmunizedforfivetimeswith5.010一10108/mlsuspensionmadeofinactivatereferencestrainsafter1824hculturein37oc.fhetitersofantiserumweretestedwithbacteriaagglutination.resultstheantiserapassessed

16、ahighefficiencyofagglutinationtiters.theantiserahadnocross.reactionwithotherreferencestrainsandwithagoodspecificity.conclusiontheantiseraproducedinthisstudywouldprovidetheusefuldiagnosticreagentsfordetectingpathogenicbacteriainlaboratoryanimals.keywords:laboratoryanimal;bacterium;diagnosticserum关于参考文献的写作要求文献指作者在论文中直接引用的,最主要的,发表在正式出版物上的文献.未正式发表的文献(包括私人通讯,毕业论文等)一般不作为文献引用,必要时可作为脚注处理.参考文献的作者不超过3个人时全部列出,多于3人时只列前3人,后加等字或etol.姓名采用姓前名后的形式,外国人姓写全称,名缩写,作者之间用逗号分开,而不用和或and.外国期刊名可缩写,但必须标准,规范.引用论着要写明书名,版次,出版地,出版社,出版年和页码等,引用期刊要写明标题,期刊名称,出版年,卷期和页码等.参考文献书写格式举例:期刊:1阴赖宏,马红,刘乃慧,