'13C代谢通量分析的介绍改良和应用研究

1、 中国科学技术大学博士学位论文C代谢通量分析的介绍，改良和应用姓名：申铁申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：施蕴渝20100428 摘要摘要近十年来，系统生物学的概念和理论得到了迅速的发展，系统生物学的研究在各处如火如荼地开展。系统生物学的核心便是要整合各个层面，各个构成要素的知识。这些层面当中，除开耳熟能详的基因组，转录组，蛋白质组和表型组外，代谢组(Metabolome)和通量组(Fluxome)成为越来越重要一个组成部分。对这两个体系的研究产生两个新的组学，一个是代谢物组学(Metabonomics)，一个是代谢通量组学(Fluxomics)。前者重点对目标体系内的所有

2、代谢物进行定性和定量，而后者则重点对目标体系内的代谢通量的速率的方向和大小进行测定。这些信息对刻画生物系统的生理特性、评估遗传和环境对细胞的影响具有重要意义。另一方面，通过识别特定的遗传操作和环境条件的控制，以增强生物技术过程的产率及生产能力的现代代谢工程也在快速发展中。代谢工程一个前提就是要量化代谢通量并将其与工程分析方法和分子生物学综合技术结合。因此，这也对通量组(Fluxome)学的发展提出了更高要求。代谢通量组学的主要研究手段是代谢通量分析，它可以分为纯计量性代谢通量分析和 13C代谢通量分析两种。其中 13C代谢通量分析是近十多年来，国际上新发展并仍然处于发展当中的技术。它除开具有纯

3、计量性代谢通量分析的能力外，还具有获取信息更多，适用范围更广的优点。它能获得代谢途径的交换通量，并且不依赖于除稳态假设外的其他生理假设，因而适用各种试验条件。国内已经有很多家单位开展了代谢物组学和纯计量性代谢通量分析的研究，并取得了不错的结果。但是对于 13C代谢通量分析技术，国内还未见有博士论文专题研究。本博士论文的内容主要分成三部分，分别是介绍 13C代谢通量分析平台，对13C质量同模子检测技术进行了发展，并利用 13C代谢通量分析研究了大肠肝菌在超氧化应激情况下中心代谢通量的变化情况，得到一些有趣的结果。论文的第一章阐述了 13C代谢通量分析平台的建立。这包括 13C代谢通量分析的理论综

4、述和实验平台建立描述。I 摘要第一章的第一部分详细介绍了 13C代谢通量分析的基本理论。代谢通量分析的基础是代谢通量拟稳态假设。在此假设基础上，可以建立各个代谢物的物质平衡方程。13C代谢通量分析实验在培养底物里引不完全 13C标记。13C会分布到所有代谢物中，而由于 13C在代谢物中数量和位置的不同，可以得到同一种物质的不同的 13C同模子和质量同模子(同模子的一类特殊组合形式)。从同模子概念出发，通过原子转移矩阵和同模子转移矩阵，可以将物质平衡方程推广到同模子守恒方程。通过对中间代谢物建立同模子守恒方程组，可以得到代谢通量相对通量和代谢物的同模子分布之间的确定但是隐式关系。这个关系是一个较

5、为复杂的多元二次方程组。当我们测量了同模子分布的信息，依据此大规模的方程组和参数优化的数值方法，可以反推出代谢通量相对通量。同时，通过构建理论的测量值空间，利用 Monte Carlo采样，仿照此求解过程，可以估计代谢通量的置信区间。第一章的第二部分详细介绍了 13C代谢通量分析的检测技术对于估计最后的代谢通量而言，我们需要获取两方面的信息。一方面是关于同模子比例的信息。通过核磁波谱，可以获得特定的同模子组合的比例信息。这包括非恒时的 HSQC脉冲序列，它主要用于测量，单键相连接的 13C异构体组合；HSQC(HMQC)-TOCSY，用于测量包含多个键的 C异构体组合。通过质谱，可13以测量质

6、量同模子比例的信息。另一方面是关于代谢物流出代谢体系的量值信息。一部分中间代谢物的流出量值通过细胞的生物质的质量和成分构成；还有一部分中间代谢物的流出量值，通过测量这些中间代谢物在培养液中的残留浓度来获取。论文的第二章阐述了对 13C质量同模子检测技术所作的改进，改进后的方法可以提高质量同模子比例的测量确度，从而提高 13C代谢通量分析的准确度。第二章的第一部分详细介绍了用质谱进行 13C质量同模子检测的基本假设，并对该假设进行了数学化的描述。利用该数学描述，对之前的各种提高质谱测量确度的方法进行了分类和描述。这些方法分可分为线形插值，构建非线性对应关系，以及进行理论修正等几类。这些方法都有非

7、常明显的效果，但有一个共同的缺点，就是只针对某一种特定类型的质谱，不具有普适性。II 摘要第二章的第二部分又分两块，第一块是关于如何提高 13C质量同模子检测确度的方法。利用已知了同模子比例的样品，作为标准样，制作任意质谱仪的校准曲线，是一种最具有广泛性的提高测量精度的方法。我们使用以甲醇作为碳源的嗜甲基菌 Methylobacterium salsuginis sp.，将其在排除了天然 CO2的环境下，以13C标记的甲醇作为唯一碳源培养。产生的各种生成物的同模子比例可以用二项式公式来计算。我们引进一个新的量，它是两个连续的质量同模子(13C原子数目相差 1)的比值，由此避开了对多维向量进行校

8、准的麻烦。而且，我们后验地测定每个产物的整个分子的平均 13C比例，从而使得生物同位素效应的对 13C分布不均匀性的影响降至最低。第二块则是对第一块的理论的实验实现，包括实验程序，理论模拟和结果讨论。经过校准后的结果，其绝对误差都小于 0.9mol%，比未校准的结果有明显进步。而且，若采用理想的实验步骤，则误差可预计下降到 0.4mol%以下。第三章是关于 13C代谢通量分析研究了大肠肝菌在超氧化应激情况下中心代谢通量的变化情况。这部分内容是由芮斌同学和我共同完成的。第三章第一部分是关于大肠肝菌氧化应激的背景综述。氧化应激，即机体活性氧自由基(reactive oxygen species,

9、ROS)与抗氧化系统之间平衡失调应起的一系列适应性的反应。许多的研究表明，中心代谢系统中的关键酶如葡萄糖 6磷酸脱氢酶(G6PDH)，-酮戊二酸脱氢酶等，在抗击活性氧自由基过程中发挥了重要作用，同时他们自身的数量和活性也因为氧化应激而受到影响。但是，到现在为止，在大肠杆菌中，还缺少一个全面的，定量的，氧化应激下中心代谢系统响应的模型。第三章第二部分详细介绍了对于大肠肝菌在百草枯引起的氧化应激情况下中心代谢通量分析的所有实验程序和参数设置。第三章第三部分是大肠肝菌在百草枯引起的氧化应激情况下中心代谢通量分析的具体结果。我们发现细胞中心代谢通量的重新分布。三羧酸循环整体途径通量下降，而乙醛酸途径，

10、磷酸戊糖途径加强得到加强，；同时，胞外的乙酸和-酮戊二酸分泌量明显增大。III 摘要关键词：13C代谢通量分析，代谢组学，系统生物学，质量同模子测量，生物合成样品，校准曲线，质谱，氧化应激，代谢通量响应。IV 英文缩写词表英文缩写词表ACA: acetyl coenzyme AAKG: a-KetoglutarateE4P: erythrose-4-phosphateFru6P: fructose 6-phosphateGLC: glucoseGlc6P: glucose-6-phosphate6PG: 6-Phosphogluconic acidGAP: glyceraldehyde-3-p

11、hosphateOAA: oxaloacetic acidSUC: succinateGLY: glycineGlyoxy: glyoxylateICIT: isocitrateMAL: malatePYR: pyruvatePEP: phosphoenolpyruvatePGA: 3-phosphoglycerateRib5P: ribose 5-phosphateRul5P: ribulose 5-phosphateSed7P: sedoheptulose 7-phosphateXul5P: xylulose 5-phosphateEry4P: erythrose 4-phosphateS

12、ER: serineT3P: triose-3-phosphatehxi: glucose phosphate isomerasepfk: phosphofructokinaseeno: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and enolasepyk: pyruvate kinasegdh: glucose-6-phosphategnd: 6 phosphogluconate dehydrogenasesrpe: ribulose 5-phosphate 3-epimeraserpi: ribose 5-phosphate isomerasetk

13、1: transketolase 1tk2: transketolase 2tal: transaldolaseedd: 6-phosphogluconate dehydrase and 2-keto-3-deoxyglucosephosphate aldolasepox:pyruvate oxidasepdh:pyruvate dehydrogenaseack: acetate kinaseglta: aconitase + citrate synthase128 英文缩写词表idh: isocitrate dehydrogenaseakd: a-Ketoglutarate dehydrog

14、enasefum: fumarasemdh: malate dehydrogenasegs1: isocitrate lyasegs2: malate synthaseppc: phosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinasemez: malic enzymethd: transhydrogenaseTBDMS: tert -butyldimethylsilyl substituentTPP: thiamine pyrophosphateDTT: dithiothreitolDTNB: 5, 5-dith

15、iobis (2-nitrobenzoic acid)DPG: 2-phosphoglycerate129 中国科学技术大学学位论文原创性和授权使用声明本人声明所呈交的学位论文 ,是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

16、保密的学位论文在解密后也遵守此规定。作者签名：_ 年月日 第 1章 13C代谢通量分析介绍第一章 13C代谢通量分析介绍第一部分 13C代谢通量分析技术的理论综述1. 系统生物学新分支代谢通量组学1.1系统生物学，代谢组学，代谢通量组学1953年沃森和克里克建立了 DNA双螺旋结构模型，生命科学研究开始进入分子生物学时代分子生物学采取的是还原论的方法，它的基本模式：首先将一个复杂的事物依据某种原则分成多个小的组成部分，然后进一步将这些组成部分分成更小的子组成部分，直到能对这些更小的组成部分进行严格而又透彻的分析，然后在对这些组成部分认识的基础上来了解整个系统。分子生物学使认识复杂的生命网络成为

17、可能，而对这些复杂过程有了一定认识后却发现分子生物学的还原论方法面对如此复杂的问题有很大的局限性这种以单个基因单个代谢途径或单个生命现象为对象进行的研究不可能为我们提供足够的资料以达成对生命整体的认识。同时，由于视野的限制，这种还原论的研究还可能被一些假象所迷惑，使人形成一些错误的认识。生物学的发展需要新的范式加以推动，系统生物学呼之欲出。系统生物学是采用系统科学的方法，将生物不是作为孤立的很多部分而是作为整体系统来定量研究它借助多学科交叉的新技术方法，研究功能生命系统中所有组成成分的系统行为相互联系以及动力学特性，进而揭示生命系统控制与设计的基本规律系统生物学将不仅使我们全息地了解复杂生命系

18、统中所有成分以及它们之间的动态关系，还可以预测如果这个系统一旦受到了刺激和外界的干扰，系统未来的行为是什么。系统生物学的研究内容主要从以下不同的层面展开：1理解系统的结构如基因调控及生化网络，以及实体构造；2理解系统的行为定性定量地分析系统动力学，并具备创建理论或模型的能力，可用来进行预测；3理解如何控制系统研究系统控制细胞状态的机制；4理解如何设计系统根1 第 1章 13C代谢通量分析介绍据明确了的理论，设计改进和重建生物系以系统和整体为研究目标的系统生物学表现出如下的特点：1从整体水平开展研究系统生物学将生物系统的所有元素(如基因 mRNA蛋白质蛋白质相互作用等)一起研究，研究这些元素之间

19、在响应生物或者基因结构扰动时的关系这样就可以将不同层次上的信息整合在一起，最终可以在任何给定的条件下描述生物系统的行为将来我们可以通过生物修饰或者药物设计出具有全新性质的生物系统 2注重对信息方法的利用系统生物学利用面向信号和系统的方法研究细胞内细胞与细胞之间的动态过程 3采用建模分析的方法，在实际应用过程中的意义通常是数学建模和模拟。而系统生物学得以发展的基础前提是海量的组学数据。这些组学数据中，除开耳熟能详的基因组，转录组，蛋白质组和表型组外，代谢组（Metabolome）和代谢通量组（Fluxome）成为越来越重要的组成部分。与代谢组相对应的是代谢组学(Metabonomics)，其重点

20、是对目标体系内的所有代谢物进行定性和定量,所关注的是整个代谢物组的变化。而与代谢通量组学相对应的是代谢通量分析（Metabolic Flux Analysis，MFA），而相比于基因组，转录组，蛋白组等信息，代谢通量数据有着自身的优势，因为代谢通量分布直接刻画了生物体生理状态，是遗传、代谢调控和环境等因素综合作用的结果，而其它组学只是分别从各自的角度描述了生命系统。将通量组信息与其它组学信息（基因组，转录组，蛋白组等）相结合对细胞进行全面分析已经成为目前和今后研究的一个重要方向。而 MFA是定量分析稳态条件下微生物代谢系统最有效的方法，适合用来精确地确定代谢网络中的通量分布，分析系统的代谢能力

21、，评估基因和环境对细胞的影响等。它以组群指标分析为基础,以高通量检测和数据处理为手段 ,以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的重要研究领域 ,反映的是外界刺激或遗传修饰的细胞或组织的代谢系统应答变化。这些信息对刻画生物系统的生理特性、评估遗传和环境对细胞的影响具有重要意义。1.2代谢通量分析及其在代谢工程中的重要意义不仅仅是系统生物学的发展离不开流量组学。而且，代谢工程的兴起和发展对作为其基础的流量组学也提出了越来越多的要求。代谢工程是一门用分子生物学原理系统分析细胞代谢途络，并通过 DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学2 第 1章 13C代谢通量分析

22、介绍科。l99l年，Bailey用代谢工程（metabolic engineering）的术语来描述利用 DNA重组技术对细胞的酶反应，物质运输以及调控，能进行遗传操作，进而改良细胞生物活性的工程。这被认为是代谢工程向一门系统学科发展的转折点。此后，也开始了对代谢工程的广泛地研究。代谢工程的一个崭新观点是关注代谢途径的组合而非单一的反应因此它必须考察完整的生化反应网络，重视途径和目标产物的热力学可行性、代谢通量及其控制。对于新兴的代谢工程而言，代谢通量分析是一个基础，并且广泛有用的工具。它正处于一个蓬勃发展的时期，将为未来的代谢组学，以及其与其他组学融合形成的系统生物学的发展提供重要的支持。细

23、胞体内各途径代谢通量的定量化表征是细胞生理学和代谢工程的重要目标尤其是生物活性物质的大规模发酵生产过程中，对实现底物高效转化为目标产物具有指导意义。代谢通量分析作为一种专门对代谢途径流量进行测定分析的方法。在测定胞外物质的基础上，通过细胞内各种生化反应的化学计量可以计算出胞内各物质的流量分。相比之下胞外流量是通过对细胞底物摄取率及产物分泌率的测定而获得的。代谢通量分析最终任务是绘制完整的代谢过程流量图，该图包括由各相关反应组成的完整代谢途径及各代谢物在稳定态时的流量精细分布。代谢通量分析除了能定量地描述各个代谢反应外，还有以下几个作用：（1）在细菌培养过程中使用特定的突变株或直接改变操作条件往

24、往会导致节点处物流量分配发生变化，通过分析比较这种变化可以确定该节点的刚柔属性。通常刚性节点的分支流量不会发生较大的改变，而柔性节点分支流量会随着环境或细胞性状改变进行相应调节。因此准确界定代谢网络中的刚性节点和柔性节点对途径操作的设计有非常重要的作用。（2）选择途径的辨别生化反应的化学计量是细胞代谢通量分析的基础，而精确的化学计量又需要对相关生化反应详细背景知识的了解。然而在许多微生物细胞中，生化反应的分子机制并不是非常清楚。代谢通量分析能够帮助人们辨别哪些途径对产生目标产物最优，哪些选择则在物料平衡状态下是不可实现的。从而保证靶途径确定的准确性和有效性。(3)非测量性胞外物质流量的计算有时

25、可测定的胞外流量数相对于需通过计算才能获得的胞内流量数是非常3 第 1章 13C代谢通量分析介绍小在这种情况下根据先前实验结果建立起来的流量分割率可以直接计算非测量性物质的流量。例如，目标产物相对于副产物的生成速率即可通过化学计量及已测定的代谢通量推算而得系统研究代谢通量及其控制机制有三大基本步骤：第一，建立一种能尽可能多地观察途径并测定其流量的方法。为了做到这一点，通常从测定细胞外代谢物的浓度入手进行简单的物料平衡。这里必须强调的是一个代谢途径的代谢通量并不等于该途径中一个或多个酶的活性。事实上酶法分析并不能提供途径真正的代谢通量信息，除非相应的酶在体外分析条件下存在并具有活性。在代谢分析中

26、酶法分析经常会错误地显示相似数量级的代潮流，导致产生不正确的结论。第二，在生化代谢网络中施加一个已知的扰动以确定在系统松散之后达到新的稳态时的途径代谢通量。常采用的扰动方式包括启动子的诱导、底物补加脉冲、特定碳源消除或物理因素变化等。虽然任何有效的扰动对代谢通量的作用都是可以接受的，但扰动应该定位于紧邻途径节点的酶分子上。一种扰动往往能提供多个节点上的信息，这对于精确描述代谢网络控制结构所必需的最小实验量是至关重要的。第三，系统分析代谢通量扰动的结果。如果某个代谢通量的扰动对其下游代谢通量未能造成可观察的影响，那么就可以认为该处的节点对上游扰动的反应是刚性的，与之相反的情况则称为柔性。在刚性节

27、点处，试图通过改变上游酶活性来影响下有代谢通量的做法是徒劳的。2计量代谢通量分析研究进展综述2.1计量代谢通量分析代谢通量分析主要可分为两大类：基于计量平衡的 MFA和基于碳十三标记实验(13-Carbon Labeling Experiment，13CLE)的 MFA。前者以通量平衡分析(FluxBalance Analyis，FBA)为代表，根据代谢网络中的物质守恒原理分析平衡代谢通量的分配情况，输入数据主要来源于胞外通量的测量，是一种传统方法。而基于碳标记实验的代谢通量分析 (13C MFA)是后来发展起来的更为强大的定量方法，碳标记测量数据为方法提供了大量的输入信息，是目前唯一的代谢通

28、量分布精确分析方法。尽管两类方法在原理、实施和结果上都存在不同，但运用 MFA4 第 1章 13C代谢通量分析介绍来分析稳态条件下微生物代谢通量分布的过程却是统一地遵循系统生物学方法论(图 1.1)。图 1.1代谢通量分析的方法论框架。首先，我们根据定性的生物学知识建立系统模型，刚开始时这个模型可能还不足以充分描述生物系统，表现为模型中存在一系列的参数需要进一步调整确定。在系统模型的基础上，运用计算机来模拟生物系统的运作(称为“干”性实验)，由于模型中参数的原因，前期的模拟结果会跟真实生物试验(称为“湿”性实验)得到的值有较大的差异，接下来根据这种差异，不断调整模型中参数的取值，再考察模拟结果

29、和真实结果间的吻合程度。循环继续这个过程，直到“干”实验和“湿”实验的结果误差落在可容忍范围之内，此时认为两者吻合，调整得到的模型就能够较真实地反映生物系统的性质了。系统生物学分析方法的目标是在定性知识的基础上获得了关于生物系统的定量知识，得以更全面、更深入地认识生物系统，解释和发现一些有意义的生命现象。具体在 MFA中，定性的生物学知识主要是代谢网络的结构，代谢通量约束关系和代谢目标的选择等，这些内容中有的是从教科书上可以直接获得的，而有的却没有现成的答案可用，需要在分析中调整改进，例如代谢目标是对细胞代谢行为的某种假定，假设的成立与否是有待验证的。分析中用到的数学模型包括 FBA中对代谢网

30、络建立的计量平衡方程组 8，13CMFA中构建的同模子 (Isotopomer)平衡方程组 9等，这些模型反应了网络中通量之间的线性联系，定义了表征代谢状态集合的通量空5 第 1章 13C代谢通量分析介绍间，以及网络中通量分布与碳同位素分布之间的非线性关系。模型中待调整的参数是通量分布的具体取值，MFA做精确量化分析的目标是给出一组充分逼近系统中真实情况的通量分布图通量分布图是细胞内部基因调控和外部环境综合作用确定的，是细胞的一种表现型，刻画了细胞所处在的独特的生理状态，对应于通量空间中的某个具体的解。在模型的基础上，13C MFA在计算机上模拟碳标记实验，FBA在计量平衡定义的通量空间中优化

31、目标函数，得到稳态情况下Isotopomer和通量在网络中的分布情况，这就称为 MFA中的“干”性试验。“湿”性试验包括细菌的培养，碳同位素标记，计量代谢通量分析是在上个世纪 80年代中后期发展起来的，当时通量分析的基础是代谢网络的计量平衡模型(称为 Stoichiometric MFA)10 ，以测量得到的胞外通量作为主要的输入数据，据此来推断胞内的代谢通量分布 11,12。根据代谢途径中各反应的计量关系以及实验中测得的底物产物的速率及细胞组成确定整个代谢网络的通量分布。该方法自产生以来，得到了长足的发展，是早期 MFA最基本的方法，1993年 Vallino等人11用这个方法首次描绘了完整

32、中心代谢的代谢通量图(MetabolicFlux Map)。这种方法构建的系统往往是不定的(under-determined)，方程组中存在一定的自由度，没法唯一确定胞内的所有通量。常常需要引入目标函数来对生化系统作一些假设，以这些假设作为优化的目标，例如常见的假设有能量平衡、ATP产率最小、最大增长率等。这种计量方法以通量平衡分析为代表，是一类基于约束的方法，具有实验相对简单，操作性强，模型构建容易，方法灵活，理论较完善，代谢网络分析能力强，适合分析中大规模网络等优势，现在依然是研究的热点。代谢目标的引入，既是方法灵活和分析能力强的体现，同时也让方法实施的合理性存在一定的疑问。因为目标函数的

33、引入是对细胞代谢行为的特定假设，这些假设是否真的成立是值得怀疑的，至少在有些代谢网络上已经证明了能量平衡是不成立的13,14。而且这种纯粹的计量方法也无法处理代谢网络中的空循环、双向反应、并行反应和交换通量等15,16。2.2计量矩阵分析法在代谢通量分析方法中，计量矩阵分析法是最早提出来的一种基于计量模型6 第 1章 13C代谢通量分析介绍的方法，其基础是拟稳态假设即质量平衡方程。根据代谢途径中各反应的计量关系以及实验中测得的底物产物的速率及细胞组成确定整个代谢网络的通量分布。设胞内存在 J个反应，涉及到 N个底物 S，M个代谢产物 p和 L个胞内变量 x(包含内中间代谢物和生物大分子物质)，

34、则其计量方程可写As + Bp + Kx =0(1.1)其中 A,B,K是包含所有计量系数的矩阵,设 J个反应的速率向量为 r (mols/g干重/h)则底物的比利用速率和产物的比生成速率分别为r s= -ArT，r = -BrTp(1.2)(1.3)对于胞内变量而言产出速率为RKr -UXT其中 X为胞内组分的浓度(mol/g干重)-UX项为菌体生长时，由于基质扩大而产生的胞内组分的稀释项，U为比生长速率。代谢通量分析中速率向量 r中的元素由 rs，rp，和 R计算得而得到确定条件下菌体内的通量分布。根据拟稳态假设，由 C个代谢中间物可得到 C个关于速率的约束条件。鉴于胞内中间物的量很小可省

35、略式 1.3中的稀释项得到KcrT 0(1.4)其中，r是计量系数为 0的子矩阵。若需确定的总的速率数目为 J则待解问题的自由度为：F=J-C(1.5)通过实验测得某些胞外物质的消耗或生成速率，设可测速率数为 m，只要 mFf就可以确定整体通量分布。对于 mF的体系，由于模型中约束方程的个数小于未知通量的个数，因此模型通量的解是不确定的 ,这样的体系被称为不定体系；对于 m=F的体系有唯一解，称为正定体系；对于 mF 的体系方程7 第 1章 13C代谢通量分析介绍数目大于未知通量个数，不但有唯一解而目可以对体系进行验证，称为超定体系。体系不同，应选择不同的求解方法，进行代谢通量分十的计算。求解

36、不定体系通常要设定一个优化的目标，寻求在目标优化的前提下，得到模型通量分布的估值;求解正定体系可直接应用矩阵变化法；求解超定体系一般采用最小二乘法。2.3计量代谢通量分析发展历程计量方法发展过程中的重要事件有：1984：Papoutsakis就开始运用线形规划方法来计算代谢的最大理论产出17。1986：Fell和 Small则用线形规划来研究脂肪的生成 18。1992：进入 90年代后，FBA开始迅速发展，Savinell和 Palsson对 FBA作了详细的分析，从而奠定了其理论基础 19,20。1993：Varma和 Palsson运用 FBA描述了大肠杆菌的性质 21,22。1997：P

37、ramanik和 Keasling使用 FBA研究了细胞生长速率和 Biomass浓度的关系 23。2000：Edwards和 Palsson对大肠杆菌进行了基因敲除、相平面(phaseplane)和鲁棒性等分析 24,25， Schilling等则将 FBA与极限代谢途径分析(extremepathwayanalysis)进行了结合 26。2001：Burgard和 Maranas研究了大肠杆菌的性能极限，得到了最小反应集合 27， Covert等将调控约束加入到了 FBA模型 28。2002：Mahadevan等发展了动态的通量平衡分析，用来研究基因调控中的动态变化情况 29。 Beard

38、等在 FBA中引入了非线性的能量平衡约束，用来量化胞内代谢物的浓度，但是无法保证得到的解是全局最优 30。下一代 FBA的发展方向主要包括 8：1，探索新的目标函数来更全面、更深刻地研究微生物代谢的能力、极限和鲁棒性等。 2，引入更多的生物知识作为系统约束，如调控约束和热动力学约束等。3，发展动态 FBA，分析非稳态条件8 第 1章 13C代谢通量分析介绍下的细胞代谢行为。3 C代谢通量分析133.1 C代谢通量分析发展和历程13比计量更为精确的 MFA方法是基于碳同位素标记实验的 13C MFA31，与计量方法相比，最主要的区别在于 13C MFA使用了碳标记实验。碳同位素标记实验以特定的

39、13C标记后的底物(例如1- C葡萄糖和天然葡萄糖的混合物)作为生物系统的摄取物，经过一段时间的内部反应，待整个系统达到稳定，此时带标记的碳原子分布到了代谢网络的各个位置，这样就可以通过核磁共振或者质谱等仪器来测量其中一些位置上的 13C同位素的标记量，这些数据为代谢网络胞内通量的量化分析带来了约束信息，根据这些信息可以对生物体内的通量进行精确的分析。到目前为止，13C MFA是唯一不依赖于代谢网络的通用的、精确的通量分析方法，在国际上得到了广泛的研究和应用 15 。与计量方法相比，这是一种更强大，更可靠的通量定量分析方法，同时也是一种更复杂的方法。首先，实验操作非常复杂。微生物细胞需要粉碎，

40、大分子需要水解，还需要准备大量的测量样本，碳同位素标记实验需要长时间的连续培养。其次，碳同位素标记实验中使用的标记底物价格不菲，例如目前市场上 1克1-13C葡萄糖大约需要100美元。而且，实验要求的前提条件也更多，细胞需要同时达到代谢和同位素标记稳态，还假定同位素标记和实验测量对细胞代谢无影响。另外，计算也更加复杂，内部的数学模型常常涉及上千维的矩阵运算，经常需要迭代和随机搜索，计算一般都须花费几个小时甚至几天。13然而，13C MFA近年来得到了迅猛发展，实验技术和计算方法的进一步改进和完善使得其操作复杂性有所缓解，例如运用现代更为成熟的样本准备程序和高精度的测量仪器，可以将实验时间从原来

41、的几个星期缩短到几天，而且不断涌现的强大计算分析系统和硬件计算能力也降低了数据分析的难度。总体而言，13C MFA的发展经历了下面几个主要的里程碑：1982：Blum和 Stein将基于 C标记的代谢通量分析应用到了 Tetrahymena14细胞，在当时该分析方法极度地耗时 32。9 第 1章 13C代谢通量分析介绍1988：Malloy等人在研究心脏内柠檬酸循环活动时，在同位素分析方面做了初创性工作 33。1995：Zupke和 Stephanopoulos基于一个通用的数学建模方法完成了第一例代谢通量分析 34。1996：Marx等人生成了第一个标记数据集，有超过 25种 H NMR测量

42、数据1包含在内 31。1997：Wiechert等人第一次详细论述了带有 H NMR测量数据的 C代谢通1 13量分析中的通用统计分析方案 35。1998：Schmidt等人在大肠杆菌上用参数拟合方法对 H/ C MFA 2D COSY1 13NMR数据进行评估(Schmidt,Nielsenetal.1998)。1999：Sauer和 Bailey对 C代谢通量分析中最有前途的方向-细胞能量代谢13作了研究 36。1999： C代谢通量分析中质谱仪数据的引入带来了新的数学问题，Park等13人用一种适用广泛但并非通用的建模方法研究了 C.glutamicum中的回补通量37。1999：运用

43、C代谢通量分析来比较不同的生理状态是 C MFA最为普遍的13 13应用，Graaf等人在 Zymomonasmobilis上作了相关工作 38。2000：Christensen和 Nielsen针对 Peniciliumchrysogenum提出了第一个通用的质谱数据评估方法 39，然而他们对数据中蕴含的信息没有加以完全利用。2000：Wiechert和 Wurzel提出了一个通用的、易于计算的 C MFA框架 40。132000：Petersen等人第一次结合通用建模方法和实验设计方法，确定了C.glutamicum中的四个回补通量 14。2002：vanWinden等提出了基于 bond

44、omer标记实验的 C MFA41，相对13于 isotopomer模型，节省了计算时间。2003：John等将微量滴定板技术成功应用到赖氨酸产氨棒杆菌的生物反应10 第 1章 13C代谢通量分析介绍体系中，实现了 13C MFA在微型规模培养条件下的进行 42。2003：Drysch等利用产氨棒杆菌进行 L-赖氨酸中等规模生产时，首次将生物传感器反应器技术与 13C MFA相结合 43。2004：Fischer等采用微量滴定板技术与摇瓶培养平行实验，分析了底物不同标记模式对大肠杆菌中心碳代谢通量计算的影响 44。2005：Wiechert等系统地介绍了 C标记实验中引起系统震荡的因素，以13

45、及如何最大限度地克服系统震荡，从而使 13C MFA在可允许的非稳态条件下进行 45。13C MFA特别需要实验技术和计算技术的紧密结合，二者的共同发展才能极好地推动这种代谢通量精确分析方法进步。在实验方面，微量滴定板(microtiterwell-plate)技术将推动 C MFA朝着小型化、高通量和降低实验成本发13展，传感反应器(sensorreactor)技术则有可能引入生物大规模培养体系，推动 13CMFA应用到工业化水平。计算方面的重点是降低分析模型的复杂度，通量估计结果的可靠性评估和非稳态条件通量分析等。总的趋势是推动 13C MFA朝着降低复杂度、实施容易、成本更低、非稳态分析

46、和更大规模网络应用发展。另外，计量方法一般用来分析中大规模代谢系统的能力等，而标记分析方法更适合对网络中心代谢途径通量的精确量化，它们两者的优势和劣势基本上是互为补充的，将它们结合起来分析也是代谢方法研究的一个新颖方向。3.2同模子和质量同模子13C代谢通量分析的前提是对代谢系统的底物，进行13C标记，利用13C产生的额外约束来反映通量信息。3.2.1同模子首先介绍同模子(Isotopomer，I)概念。相同的化合物，若存在人工的 13C标记，则会由于 13C在分子中数量的多少，排列位置的不同而被区别开来。因为 13C标记不同，而产生的所有可能的化合物组合，统称为 13C同模子组，而每一个单独

47、的分类，则称为该化合物的 13C同模子。由于每一个碳原子，存在 12C，13C两11 第 1章 13C代谢通量分析介绍种可能。所以，含 n个碳的化合物的 13C同模子总共有 2n种。如图 1.2对于一个3个碳原子组成的化合物，则共有 2 =8种同模子。3图 1.2 3个碳原子形成的同模子和质量同模子图示。中间的数字为同模子编号.大括号下的同模子属于大括号上面的质量同模子。Ni l es en。对于n个碳原子的化合物，我们可以根据 12C，13C的排布来进行编码，从而使得每种Isotopomer可以用一个n位的二进制数来表示。常用的编码规则为，将n个碳原子按照化学命名法则排序，然后根据第 i个碳

48、原子的同位素来决定二进制数第i位的取值：若为12C，则取值为0，若为13C，则取值为1。由此每种Isotopomer可得到一个确定的二进制数。若将这些二进制数转为十进制数，刚好就是02n-1于是用Ij来表示十进制数为j的同模子。例如，010，这个二进制数表示十进制数为2，则I2对应如图1.2的第3同模子。而一个3碳原子组成的化合物的同模子可以用数字07来编码，表示为I0I7。，对于Isotopomer组而言，最重要的信息是各种Isotopomer的相对丰度，或者说其占整个化合物丰度的比例。我们使用同模子分布向量(Isotopomer DistributionVector，IDV)来描述各种Is

49、otopomer的相对丰度。含N个碳原子的化合物同模子分布向量IDV，为1 2n维。该向量的第j个元素对应的就是同模子Ij-1的相对丰度Ij-1(注意下标的不同)。当一个化合物的IDV确定后，其 C标记的所有细节即已确13定。12 第 1章 13C代谢通量分析介绍3.2.2质量同模子Isotopomer还可以按各种规则衍生组合成更高级别的组合物。在13C代谢通量分析里，最常用的一种组合物称为质量同模子(Mass Isotopomer)。它是指含有的13C数量相同的所有Isotopomer的组合物。对于n个碳原子的化合物，共有n+1种质量同模子，分别含有0，1直到n个13C。含有j个13C的质量

50、同模子用Mj来表示，Mj由C(n，j)个同模子向量组成。如图 1.2的大括弧表示了 3碳原子组成的化合物的Mj与Ij的对应关系，M0，则就是I0，而M2则由I3，I5，I6组成。与同模子分布向量相对应，也可以用质量同模子分布向量(Mass IsotopomerDistribution Vector，MID)来描述各个质量同模子的相对丰度mj，该向量的第j个元素对应就是同模子Mj-1的相对丰度mj-1(注意下标的不同)。MID =（m m ,m ,L ,m0, 1 2 n）(1.6)普遍的说，每个质量同模子都由一组特定的同模子组成。通过同模子的编码，可以知道其对应的质量同模子组。对于Ij，将j反

51、复除以2，直至商为0，每次除法所得余数的和，就是Ij对应的质量同模子的Mi的下标i。显然，任意一个同模子都对应唯一且确定的质量同模子。通过向量表示，我们可以将IDV和MID的关系表示为MID = TIDV(1.7)这里T为对应组合矩阵，描述了从 IDV到MID的对应组合关系，T的元素为0或者1。其具体内容，则可以根据前述的余数相加关系确定。式1.7为用矩阵关系描述的IDV到MID的关系。如果只确定了一个化合物的MID，则其13C标记的所有细节还有不清楚的地方，也就是说MID含有的信息仅仅是IDV所含有信息的子集。13 第 1章 13C代谢通量分析介绍(1.8)3.3同模子映射的数学表示以上介绍

52、了描述单个化合物的静态的 13C标记状态的数学模型。显然，如果一个化合物的同模子分布向量已经确定，只要我们知道一个化学反应中，反应物和产物的碳原子的对应关系，则我们可以确定其产物的同模子分布向量。我们通过具体实例，介绍映射矩阵的概念来描述代谢模型中的每一个反应和反应对于化合物的13C标记状态的影响，并阐述如何构造映射矩阵从而得到描述整个稳态13C标记实验的数学框架。3.3.1原子映射矩阵我们首先介绍原子映射矩阵(Atom Mapping Matrix)。为阐明原子映射矩阵的作用，我们将每个同模子用向量表示。这实际上是将该同模子的前面所述的二进制编码，转换成行向量形式，然后转置成为列向量得到。在

53、转换过程中，碳原子位置仍然保持对应关系即可。这样该向量中标记的碳原子记为 1,未标记的碳原子记为0。图1. 3 5个碳的化合物A，分解成含3个碳的化合物B和含2个碳的化合物C。( ZHANGhui mi ng, 2003)14 第 1章 13C代谢通量分析介绍图1.3代表一个反应：在该反应中为显示碳原子的迁移路线，用数字表示对碳原子进行编号，而深色表示13C标记的碳原子。对于图1.3中的反应物与生成物,其同模子形式为式1.9所示。构造反应物A到反应B的原子映射矩阵MAB，该矩阵的行数为产物B中碳原子的个数，列数为反应物A中碳原子的个数，假如如A中的第n个碳原子到了B的第m个碳原子的位置上，则在第m行,第n列的位置上标记“1”，否则为“0” 。根据此构造规则可得MA B与MA C有式1.10的形式。(1.9)(1.10)这样的矩阵完整地描述了此反应中