无菌、微生物限度检查及方法验证

1、无菌、微生物限度检查 及方法验证 微生物实验室的质量管理 一、实验室设施与设备和管理（法规要求） 无菌检查、微生物限度检查与抗生素微 生物检定的实验室，应严格分开。 无菌检查、微生物限度检查实验室分 无菌操作间和缓冲间。 无菌操作间应具备相应的空调净化设 施和环境，采用局部百级措施时，其环 境应符合万级洁净度要求。 进入无菌操作间应有人流净化和物流 净化的设施。 无菌操作间应根据检验品种的需要， 保持对邻室的相对正压或相对负压，并 定期检测洁净度。 无菌操作间内禁放杂物，并应制定地 面、门窗、墙壁、设施等的定期清洁、 灭菌规程。 无菌检查在洁净度100级单向流空气区域 内进行，其全过程应严格遵

2、守无菌操作， 防止微生物污染。单向流空气区与工作台 面，必须进行洁净度验证。微生物限度检 查的全过程，均应遵守无菌操作，严防再 污染。 微生物实验室的质量管理 为满足微生物学实验要求，微生物实验室应具有： 严格分开的无菌检查、微生物限度检查、 无菌采样室。 菌种处理与微生物鉴别室有局部百级措 施。 各自分开的抗生素微生物检定、细菌内 毒素检查、抗菌作用测定半无菌室。 培养室（一般为100，000级）。 试液及培养基的配制室。 灭菌室。 实验器皿洗涤、烘干室。 人员办公休闲室。 实验用品、易耗品储藏室。 微生物实验室的质量管理 设施和设备的管理 特殊标准品菌种 培养基、缓冲液、试剂 消毒剂 文件

3、管理 培训 内审 微生物实验室的质量管理 微生物室实验室的质量管理制定 洁净室（无菌室）的使用管理规程 （SOP） 菌种处理相关的标准操作规程（SOP） 生物安全柜的使用标准操作规程（SOP） 带菌废弃物的处理标准操作规程（SOP） 环境消毒标准操作规程（SOP） 环境清洁、消毒标准操作规程（SOP） 试液及培养基配制的标准操作规程 （SOP） 实验器皿洗涤标准操作规程（SOP） 建立无菌室使用登记册 使用日期，时间，使用人，设备运转 状况，温、湿度，洁净度状况（沉降菌 数、浮游菌数、尘埃粒子数），报修原 因，报修结果，清洁工作（台面、地面、 墙面、天花板、传递窗、门把手），消 毒液名称等 微

4、生物实验室的质量管理 实验室使用管理 每天工作前用消毒液消毒工作台，开紫 外灯（最少半小时）进行空气消毒，每 月定期做彻底清洁工作，适当时用消毒 剂进行熏蒸。 非必要品禁止带入实验室，必要资料和 记录应消毒后进入并应远离操作台。 实验人员进入洁净室（无菌室）不得化 妆、戴手表、戒指等首饰；不得吃东西。 应严格按更衣程序更衣。 记录温湿度是否在规定的范围内，每次 实验时，对操作室和层流台做微生物沉 降菌落计数并记录；如发现问题应找原 因，及时报修和报告并将报修原因和结 果记录归档。如遇停电，应立即停止实 验，重新进入无菌室前，至少开启机房 运转1小时以上。 在每次实验结束时，应用消毒剂及时按 消

5、毒规程中的要求消毒操作台和洁净室 （区），并开启室内紫外灯以杀灭存留 微生物。 使用后的器具如平皿、试管，所有微生 物培养物，染菌/带菌物品等应用消毒液 浸泡（至少24小时以上），经煮沸或灭 菌后清洗或丢弃。 微生物实验室的质量管理 l洁净室（无菌室）的使用管理 每季度定期进行清洁度再验证，以确保 洁净度符合规定，保存原始记录及趋势 分析资料，定期归档保存。 至少每年一次定期更换新的紫外灯管并 记录，以确保紫外灯管灭菌持续有效， 定期归档保存。 至少2年1次，或按洁净度验证实际情况， 定期更换初效、中效、高效头。以确保 净化系统的功能持续有效，并同时在使 用登记本上做好更换记录。定期归档保 存

6、。 平时实验室内应尽可能减少人员的走动 或活动，通向洁净室的门要关闭或安装 自动闭门器使其保持关闭状态。 发现洁净度不符合规定时，应立即停止 使用，寻找原因，彻底清洁、消毒，须 经清洁度再验证符合规定后，才再使用， 并将情况记录在无菌室使用登记册上， 定期归档保存。 非微生物室检验人员不得进入洁净室 （无菌室），对必须进入的外来人员或 维修人员应进行指导和监督。 微生物实验室的质量管理 一、实验室设施与设备和管理 设施洁净室、净化工作台、生物安全 柜。 设备高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤 箱、培养箱、冰箱。 实验仪器全封闭薄膜过滤装置、电动 匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显 微镜，及刻度吸管、

7、试管、三角烧瓶、 培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录， 内容包括名称、型号、生产厂家、购买 日期。 质量保证档案：购买发票、安装验收或 开箱验收记录、调试记录、计量检定或 运行校验合格证、指定专人负责、制订 标准操作规程（SOP）、建立使用登记 册，维修、保养记录、改造或更新记录、 直至报废记录。 微生物实验室的质量管理 一、实验室设施与设备和管理 定期监测生物安全柜和（或）超净工作 台的内表面的微生物学质量及其内部的 空气质量（粒子和微生物）。使用时检 查压差指示表。 培养箱、冰箱需在设备的每个腔室内放 置经校准过的玻璃温度计，每天检查设 备腔室内的温度状况并且在日志上做好 相应

8、的记录。定期回顾每个设备的温度 记录数据，以考察设备的运行状态。 定期用中性的清洁剂或消毒剂清洗培养 箱（或室）、冷藏箱（或室）、冷冻冰 箱及水浴的腔室内表面。 高压灭菌柜、电热恒温干燥箱等需要验 证和持续监控。 仪器的校准和确认。 微生物实验室的质量管理 需要确认和验证试验和 持续的质量监控的设备 高压灭菌柜和电热恒温干燥去热原烘箱 安装确认（IQ）：要确认控制系统及其 他仪器仪表的设计是否得当并经过校验。 检查有关共用介质（如蒸气、水和空气 等）符合灭菌工艺的要求。 运行确认（OQ）：要求证明空载状态下 验证方案中所述腔室内所有关键位置的 温度是否均处在规定范围内。建立热分 布图谱。空载状

9、态下，湿热灭菌当腔室 工作温度不低于121时，各点温度与 腔室内平均温度之差不超过1 ，于 热除热源，当运行温度不低于250 时， 腔室内的温差应不得超过15 。 性能确认（PQ）：要求在满载条件，温 度探头插入待灭菌物品的内部，同时加 入一定浓度的微生物或独立的生物指示 剂。 对不同的工艺条件（物品、包装和装载 方式、灭菌参数等），分别进行性能确 认试验，包括热穿透试验和生物指示剂 挑战试验。 包括：高压灭菌 柜、除热源电热 恒温干燥箱、自 动微生物鉴别系 统和计数系统。 微生物实验室的质量管理 品种：520倍稀释的碘伏水溶液 0.10%新洁尔灭容易 1:50的84消毒液 75%乙醇溶液 3

10、%碘酒溶液 5%石碳酸（来苏儿）消毒溶液 2%戊二醛水溶液 尼泊金酒精消毒液等 应定期更换消毒剂品种，按标准准确配 制。 l清洁、消毒剂的管理 微生物实验室的质量管理 一、菌种的保存与管理 菌种特殊的标准品 应保持基生长特性和减 少污染，是微生物实验 结果一致性的重要保证。 制定菌种保藏管理制度 微生物实验室应制定菌种的保藏管理规 程来规范菌种的来源、申购、保管、转 种传代、存储和领用等方面的要求，确 保菌种的溯源性和稳定性；防止试验用 菌种因多次传代而失去典型生物学特征 发生变异或死亡，保证菌种长期正确、 稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。 菌种名称：金 黄色葡萄球菌 菌种系列号：CMCC

11、(B)26003 传代次数： 第 4 代 有 效 期： 年 月 日 制备日期： 年 月 日 传 代 人： 王熙凤 微生物实验室的质量管理 菌种保存应有专人负责，加锁保存于冰 箱中。 实验室的标准菌株应来自CMCC（中国 药品生物制品检定所医学菌种保藏中心 或ATCC（美国菌种保藏中心）等国际法 定菌种保藏机构。有接收、确认记录。 菌种的转种等均应在超净工作台进行， 以防污染。 各种菌种应按规定时间接种，所有保藏 的菌种均应贴有相应的标签，有菌种清 单。 验证实验常用菌种 枯草芽孢杆菌 CMCC （B）63501 金黄色葡萄球菌 CMCC （B）26003 生孢梭菌 CMCC （B）64941

12、铜绿假单胞菌 CMCC （B）10104 大肠埃希菌 CMCC （B）44102 乙型副伤寒沙门菌 CMCC （B）50094 白色念珠菌 CMCC（B）98001 黑曲霉 CMCC （B）9 003 菌种保藏步骤 干燥菌种复苏，划平板 挑选特征典型的纯菌菌落；（制菌悬液使用） 确定保藏的合格菌体形态； 选择最适宜的保存方法，定期对保藏菌种进行检查，观察是否 发生变化，若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行 移种。 菌种的接收 标准菌种一般是玻璃安平装的冻干粉剂 接收时应检查名称/数量和完整性。 贴好标签后储存于-20 一般安平冻干品可在5年之内使用 使用时应按（菌种保藏中心提供的）相关

13、资料的要求进行复溶、 培养和保存。 菌种的复活 l 菌种的复活 用70%的酒精擦拭清洁安瓿，自然风干 用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿开 无菌操作，用一无菌吸管无菌移取12ml适宜的液体培养基到瓿中； 轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解； 用无菌吸管将安瓶内菌液转移到相应的液体培养基中， 根据不同菌种类型而将其培养于相宜的温度下24-72小时。 l 菌种的确认 菌种复活后，应确认菌种的纯度与特性 从培养肉汤中取细菌培养物接种到平板上，上划线分离出单个菌落。 培养后观察其是否具有典型的菌落形态 然后挑取单一的纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特性及 菌形。

14、 最后再做生化实验以进一步鉴定该菌种，或用API鉴定系统做鉴定 工作。 对已经过鉴定确认的菌种就可以进行菌种的传代和保藏了。 菌种的传代和保藏 l 菌种的保藏方法 使菌种的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而在一定时间内 不发生变异并保持生命活力。 一般来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的三个 重要因素 无论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在相应保存条 件下的菌种不会变异并且性能稳定。 菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代（GMP，药 典） 将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为“一代”。 冷冻真空干燥保藏法 主要是将待保藏菌种混于有保护作用介

15、质内制成菌液，分装在安 瓿中于冷冻条件下使其快速冻结，因冻结可使晶型细致，不致损伤活 菌细胞。然后用真空抽气减压，是安瓿内的冰晶液体升华，水气迅速 被真空抽走，冰晶型的菌液很快变成疏松的干燥固体物，最后在真空 状态下熔封管口，使干燥物在局部真空条件下封存，并置冷暗处，在 很长时间内菌种仍可维持活力不变。 甘油冷冻管保藏法 将待保藏菌接种至平板或琼脂斜面，培养 用无菌接种环轻轻刮取菌台，用接种环使细菌充分扩散到预先装于 试管中的无菌蒸馏水中 调整菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第10号管 向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为20%的无菌甘油，得到 10%甘油菌悬液。 轻轻振摇小管，使内容物充分混

16、合，分装于无菌小试管。 制好的甘油冷冻管最好在-30条件下贮存。 有效期至少为2年。 氧细菌和酵母菌可用此法保藏，霉菌和厌 氧菌则不适于用此法保藏。 液体石蜡覆盖保藏法 将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中培养， 无菌操作在层流台下用无菌吸管吸取无菌液体石蜡至培养好的菌种 管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm， 将试管直立，置于28冰箱中或室温下保存，如 铜绿假单胞菌。 此法保藏霉菌、放线菌、芽胞杆菌可保藏 两年以上，酵母菌可保藏12年，一般无 芽胞细菌也可保藏1年左右。 此法制备简单，不需要其他特殊设备，并 且效果好，是传代培养的变相方法，可适 当延长保藏时间。 琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家常

17、用） 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，生长充分后，移至28 冰箱中保藏。 保藏时间： 霉菌、放线菌及芽胞的菌保存24 个月，移种一次； 酵母菌2个月移种一次； 细菌最好每1月移种一次。 优点：操作简单，使用方便，不需特殊设备，对大多数微生物都适 用。 缺点：保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。 此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌 种的短期保藏。 保藏芽胞液对 产芽胞的微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏， 无菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内，轻轻转动使菌液 均匀分布于培养基表面。 将培养皿在适当的温度下培养。一般需要7天或更长时间 在层流台下，取35ml氯

18、化钠磷酸盐缓冲液（pH7.0）加入培养皿内 用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔，注意不要划破培养基。 用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液，收集于试管中。 将收集的芽胞液放在8090水浴中加热15分钟， 冷却。 做好标记，放至28冰箱中保藏。原始 芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新标定其浓度。 微生物菌种的传代保藏过程 按菌种说明书要求复溶菌粉 菌（标准菌株），转种于适 当的增菌培养基内（此为第 一代G1），复壮后转接至平 板上，并于适当温度下培养 适当时间，分离出单个纯种 菌落（此为第二代G2） 菌种鉴定完成后，挑取纯菌 落制成浓菌悬液用于制备甘 油冷冻管，冷冻或低温保存 （标准储备菌株G2）；

19、同时 挑取纯菌落转接斜面菌种作 为工作用菌种（工作菌株 W3），于适当温度下培养适 当时间后可用于试验， 直至转为W5为止，需重新开 启安瓶，再重复上述操作程 序。 菌种被分为两类，传代用菌种和工作用菌种， 传代用菌种（标准储备菌株）用甘油冷冻管法保藏 工作用菌种（工作菌株）用斜面低温保藏法保藏 试验用菌液的制备 传代：取菌液0.1ml接种至10ml液体培养 基，按规定培养、稀释 对照用菌种在使用过程中，亦应检查其生 物学特性。如菌落形态（在可能情况下， 用选择性培养基进行生长检查）、革兰染 色、镜检菌体形态、主要生化特性（必要 时应作菌种鉴定实验）。如发现染菌或或 变异，衰退等现象时，应及时

20、处理。 为保证试验的可靠性和准确性，实验室还 应严格按照相关规程制备和使用菌种，并 对每种微生物的存贮条件（需/厌氧状态、 温度和时间）进行确认。 室温下菌悬液应在制备后的2小时内使用 低温保存（2-8）时 细菌和酵母菌的菌悬液应在制备后的24小时内使用 霉菌孢子液则应在制备后的7天内使用（黑曲霉孢子悬液可保存在28 ，在验证过的贮存期内使用） 在使用时（在24小时之内）均应同时进行菌数复核检查。 试验时可采用分光光度法或麦氏比浊法估 计菌液浓度。 菌种的制备、保藏和使用记录 1、菌种名称_菌种系列号_菌种来源_ 实验室编号_传代代数_ 2、菌种制备：培 养 基_批号_接种日期_ 接种容器_数

21、量_培养条件_温度_时间_ 纯化分离鉴定结果_操作人_日期_ 3、菌种保藏方法_保藏数量_保藏用培养基_批号_ 培养条件 温度_时间_有效期_操作人_日期_ 4、菌种使用记录 序号支取日期数量操作人用途处理 当菌种超过有效期或被污染以后应灭菌后丢弃。 是 否 说明：实验室菌种编号原则：名称+传代代数+ 制备日期 培养基管理 一般采用购自中国药品生物制品检定所合 格的商品脱水培养基。同时按照使用说明 书进行配制，需注意培养基的pH值应符合 规定，否则必须校正后，按说明书规定灭 菌。 商品脱水培养基应在有效期内使用，使用 前应注意核对名称，检查外观，遇有结块、 吸潮现象，应废弃。 新鲜培养基的配制

22、，应按质量标准规定的 配方进行，对培养基的原材料要进行挑选， 试剂应为化学纯试剂规格。制成的培养基 要求无沉淀。必要时以适当方法过滤，调 整pH值，分装灭菌备用。 灭菌：应经验证合格的灭菌程序（一定装 载方式下灭菌方法和条件）。 验证：无菌性试验，促生长试验，灭菌器 蒸汽循环系统。 培养基的质量控制 建立质量控制程序 所有配好的培养基均需进行质量控制（pH、适用性检查试验） 培养基有效期的确定：定期的稳定性检查以确定有效期（225，避光，非密闭容 器3周内使用，密闭容器1年内使用。 质量控制的频率：用同1批脱水培养基，采用经验证的配制和灭菌方法制备的培养基， 可只做1次灵敏度检验。 质量控制菌

23、株的选择（营养、灵敏、代表性） 对无菌培养基的无菌性、灵敏度检查 与对照培养基进行比较 无菌检查用需气厌气培养基的指示剂氧化层不得超过培养基深度的1/5，否则须经水 浴煮沸10分钟，但只限加热一次。无菌检查结束时，指示剂氧化层应不超过培养基 深度的1/2。 大肠埃希菌检查用MUG培养基配制前应挑选无荧光的试管进行配制，观察结果时应 用同批培养基配制的空白管和阳性菌管同时观察。 培养基的灵敏度检查：已知菌生长试验 细菌组： 取每管装量为12ml硫 乙醇酸盐液体培养基9 支，分别接种小于 100cfu试验菌各2支； 菌种： 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 空白对照：另一支不

24、接种，培养2472小 时逐日观察结果 霉菌组： 取每管装量为9ml的 改良马丁液体培养基5 支，分别接种小于 100cfu试验菌各2支； 菌种： 白色念珠菌 黑曲霉 空白对照：另一支不 接种，培养5天逐日观 察结果 l结果判 定 空白管培 养基无菌 生长 加菌的培 养基管均 生长良好 判灵敏度 检查合格。 培养基管理 配制好的培养基，按无菌要求进行灭菌。 培养基的配制须有记录，记录内容含有： 配制日期和配制人员的标识； 培养基/溶液的类型、体积； 成分、每个成分物质的含量、 制造商、批号； pH（最初和最终）值 无菌措施，包括实施的方式、 时间和温度。 按日期编制灭菌后的培养基编号 将制备完毕

25、的培养基按品种放置在阴凉的指定位置，备用。注意保 存期 灭菌法 湿热高压蒸汽灭菌法：依115、121 或132 ， 应用于培养基灭菌、试验器械、工作服、 橡胶物品和实验室废弃物，也可用于玻璃 器皿的灭菌。一般121 30min 干热法：利用物理学，171 -1小时， 160 -2小时、121 -3小时：玻璃器皿 湿热：蛋白质容易凝固 干热：氧化 检验方法学验证： l 在化学测试中，药品的测定方法需要验证，与此相应， 当建立药品的无菌、微生物限度检查法时，也应进行分 析方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无 菌、微生物限度检查。 l 证明采用药典的某种方法和检验条件，在该供试品的检 验量

26、、检验条件下，无抑菌活性或活性已消失，保证检 验结果的准确性。 检验方法学验证： l 验证时机； l 建立检验方法时； l 修订检验方法时； l 组分和检验条件发生变更时； l 定期再验证。 人员 l 人是无菌药品生产中的主要污染源，在管理比较到位。 生产设备自动化程度较好，操作人员素质较高的企业， 人员操作所致的污染率超过70%。 l 具微生物专业知识 l 经无菌技术培训 l 对实验结果能进行充分全面的评价。 其它重要影响因素 药品本身的抑菌性； 培养基的促菌生长能力； 培养条件（温度、湿度及需氧或厌氧）； 过滤系统的材质 检验的进展 强调检验的过程控制，提高检出率，保证检验结果的可靠性。

27、人员的要求 环境、设施要求 培养基适用性 检验数量 方法验证 培养时间 试验用菌 全封闭过滤培养器、隔离系统 检验结果的保证 l 要求有一个取样计划来涵盖整个批号 l 有足够的取样量和检验量 l 选择适用的培养基 l 采用经验证的无菌检验方法 l 良好的环境监控 l 人员保证 无菌检查 无菌检查 l 定义： p无菌原料药是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原 料药，包括无菌制剂和无菌原料药。 p无菌检查是检查要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料以及 要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。 l 符合无菌检查法的规定仅表明了供试品在该检验条件下 未发现细菌和真菌污染。 l 无菌检查法建立

28、在批产品受微生物污染是均匀的假设上 （其实非均匀）。无菌检出低污染的概率极低的。因此， 无菌检查存在风险和局限性。 无菌检查的局限性 l 无法对整批产品进行100%检验 l 只进行细菌和真菌的检验 l 培养基 l 培养条件（如温度和时间）是有限的 l 我们的工作环境及操作是在相对无菌的状态。 无菌检查：注射剂、植入剂、部分外用药 l 鼻用制剂：用于手术或创伤的鼻用制剂。 l 凝胶剂：用于严重创伤的凝胶剂。 l 乳膏剂：用于烧伤或严重创伤的乳膏剂。 新增的无菌检查中药制剂 l 散剂：用于烧伤或严重创伤的外用散剂。 l 鼻用制剂：用于严重创伤的鼻用制剂。 l 眼用制剂：用于伤口的眼用制剂。 l 软

29、膏剂：用于烧伤或严重创伤的乳膏剂。 l 气雾剂、喷雾剂：用于烧伤或严重创伤的气雾剂、喷雾 剂。 GMP取样 取样注意事项，包括为降低取样过程产生的各种风险所采取的预防 措施，尤其是无菌或有害物料的取样以及防止取样过程中污染和交 叉污染的注意事项； 在生产的每一阶段，应当保护产品和物料免受微生物和其他污染。 附录1无菌药品 质量控制 第八十条 无菌检查的取样计划应当根据风险评估结果制定，样品 应当包括微生物污染风险最大的产品。无菌检查样品的取样至少应 当符合以下要求： （一）无菌灌装产品的样品必须包括最初、最终灌装的产品以及灌 装过程中发生较大偏差后的产品； （二）最终灭菌产品应当从可能的灭菌冷

30、点处取样； （三）同一批产品经多个灭菌设备或同一灭菌设备分次灭菌的，样 品应当从各个/次灭菌设备中抽取。 一般随机抽样，保证样品的代表性和原始性，复试样品应尽量重现 原取样。 注意事项 只要供试品的性状允许，应采用薄膜过滤法（首选） 只要供试品的性状允许（溶解性、抑菌性），应将所有容器内的全 部内容物过滤 验证用供试品用最大量 阳性对照分开培养 大肠埃希菌代替铜绿假单胞菌（G+敏感，保证结果有效） 无菌检测14天（补偿生长条件、潜在的低生长者、修复受损细胞） 优先选用密闭式过滤器，或一次性过滤器 滤膜材质（抗用低吸附），滤膜的完整性，冲洗量。 直接法接种供试品体积不得大于培养基体积的10%，每

31、管装量硫乙 醇酸盐流体培养基不少于15ml，改良马丁培养基不少于10ml，可用 浓缩培养基，或增加培养容器数。 结果判断 l 阳性管生长良好，阴性管不得长菌，否则试验无效。 l 以一次检出为准，不得复试。（低检出率，实验环境、条 件改善 l 当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效； 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物 监控结果不符合无菌检查法的要求。 回顾无菌试验过程中，发现有可能引起微 生物污染的因素。 阴性对照管有菌生长。 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确认 是因无菌试验中所使用的物品和（或）无 菌操作技术不当引起的。 结果保证 有效的结果 可靠的结论 培养基保证 结果判断 SO

32、P操作 人 方法验证的一般程序与环节 需前处理 不需前处理 有抑菌作用样品 无抑菌作用 去除抑菌作用 检查 验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。 可以通过验 证实验判断 验证抑菌活性去除的 有效性，以及去除方法 对污染菌生长、检出的 影响。 无菌检查验证实验： 供试 品 直接 接种 法 薄膜 过滤 法 100ml /筒 试验组（供试品 +菌） 金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、 大肠、枯草杆菌、 生孢梭菌、白色念 珠菌、黑曲霉 培养基 对照组 阳性菌 对照组 （加菌同 试验组） 规定T培 养35天 观察 结果 书写验证 报告 稀释剂 对照组 微生物限度检查 微生物限度检查：口服、外用 l 控

33、制项目 杂菌数：细菌数、霉菌和酵母菌数。 控制菌（致病菌）：大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、金黄色葡 萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌、白色念珠菌。 l 制定原则：非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给 药途径及对患者潜在的危害而制定的。 l 依据标准检查控制菌 l 不含药材原粉的制剂 l 含药材原粉的制剂：丸剂 l 含动物药的制剂 l 外用制剂 滴眼剂 一般局部用药 直肠给药制剂 尿道、阴道给药制剂 滴鼻剂 l 不同制剂的限度 注意事项 l采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供 试品的抑菌活性 l供试液从制备到加入检验用培养基不得超过1小时 l供试液制备若需用

34、水浴加温时，温度不应超过45 l供试品须符合微生物限度标准和菌数报告规则，应采用使微生物生长的更高稀释级进行 验证。（10-3，1000） l无合适方法消除抑菌性的检验方法，选择回收率更接近要求的方法和条件应对生产工艺 和产品特性进行风险评估，保证检验结果的准确性和产品质量。 l报告规则（平均数，300cfu） l培养温度、培养时间变化 l检验量（中药膜剂，沙门菌） l样品稀释级的选择（验证） l离心法500转/分，3分钟（中药混悬剂重新验证，只适用细菌） l控制菌-培养基的适用性（促生长能力、指标能力和抑制能力）参照培养基（比较菌 落形态、大小、指标剂反应、生长速度）最长（抑）、最短（生）培

35、养时间。 l疑似菌确认，选择认可的菌种鉴定方法，阳性对照试验至少进行到分离的步骤。 微生物限度检查法验证 l 细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证 定量回收率测定实验 l 控制菌检查方法验证 定性能否生长、专属性实验 回收率计算 试验组的菌回收率=（试验组平均菌落数-供试品组平均菌落 数）/菌液组平均菌落数100% 稀释级对照组的菌回收率=（稀释剂对照组的平均菌落数/菌 液组的平均菌落数）100% 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组、试验组的回收率均 不低于70%，若任一次试验中回收率低于70，应重新选择方 法再验证。 方法验证：控制菌 l 控制菌：大肠埃希菌，铜绿假单胞菌、沙门菌、大肠菌群、

36、生孢梭菌 l 计数方法：平皿法、薄膜过滤法。特殊：生孢梭菌（加菌 量：10100cfu，只要求生长不要求回收率 l 制定原则：非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给 药途径及对患者潜在的危害而制定的。 l 依据标准检查控制菌 原料药/赋形剂量微生物检查 微生物能否在原料或赋 形剂中生长或存活？ 提供支持数据，不必做微生物限度 检查和制定认可标准 原料或赋形剂是否无菌？ 不需进一步做微生物限度检查法或 制定认可标准 原料/赋形剂合成/工艺相关 步骤本身是否会减少微生物 按照协议后药典各论制订微生物限 度认可标准 按照协议后药典各论制 订微生物限度认可标准 逐批检查微生物限度和 指示菌 抽批检验

37、微生物限度和 指示菌 是否有科学证明减少 步骤会造成原料/辅料 中微生物量认可限度 （未检出觉指示菌）？ 提供支持数据，不必做微生物限度 检查和制订认可标准 所监控的微生物量/指示菌 量是否都低于规定限度？ 是 否 是 是 是 否 是 是 非无菌制剂的微生物检查 制剂中是否含防腐剂或本 身是否有抗微生物能力？ 制订防腐剂认可标准和认证在低于或等 于指定的最小防腐剂浓度时是否有效， 并证明制剂本身的抗微生物能力 逐批进行微生物限度实验 按照协议后药典各论制订微生物限 度认可标准 不必做微生物限度检查 和制订认可标准 是否每批都符合微生 物限度标准？ 提供支持数据，不必做微生物限度 检查和制订认可标准 是 否 是 否 是 制剂是否为固