最新植物生理指标测定方法..

1、实验一 植物叶绿素含量的测定（分光光度法） （张宪政，1992） 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光 度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度 A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A =a CL式中：a比例常数。当溶液浓度以百 分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长 下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数 种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。 这就是吸光度的加和性。今欲测

2、定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a、b和类胡萝卜素的含量， 只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a b及类胡萝卜素在该波长 下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素 a b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色 光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素 a和b，两 者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用效率 的大小，比值高则大，贝U反之。 二、材料、仪器设备及试剂 试剂：1） 95%乙醇（或80%丙酮） 三、实验步骤 称取剪碎的新鲜样品0.20.3g,加乙醇10ml，提取直至无绿色为止。把叶绿体色素提取 液倒

3、入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm和645nm下测定吸光度。 四、实验结果按计算 丙酮法（Arnon法）【可以用于丙酮乙醇混合法和 80%丙酮提取法的计算】 叶绿素 a 的含量（mg/g） = （12.71OD663 -2.59OD663 -2.52OD645） V/1000*W 叶绿素 b 的含量（mg/g）=（20.47OD645 -4.73OD663） V/1000*W 叶绿素 a、b 的总含量（mg/g） =（7.90Vi/(0.155 W V2) 式中：Vz：反应液总量(4 mL) ;V1:提取液体积(10 mL); V2:测定用用提取液量(2 mL) ;

4、W:取样叶鲜重(g) 0.155:为MDA的消光系数(nmol/l ) 方法二： 方程组： A450= (85.4X 10 3) C 糖 (A532 A600) = (155X 10 3) CMDA+ (7.4X 10 3) C 糖 解得： A450 C 糖=11.71A450 (mmol L 1) 85.4X 10 3 Cmda= 6.45 (A532 A600) 0.56A450 (卩 mol L 1) 公式中：A450 在450nm波长下测得的吸光度值 A532 在532nm波长下测得的吸光度值 A600 在600nm波长下测得的吸光度值 * 1.55X 105为摩尔比吸收系数 C糖、C

5、MDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。 1. 按下式计算提取液中MDA浓度 反应液体积(ml) Cmda X 1000 提取液中MDA浓度(卩mol ml 1)= 测定时提取液用量(ml) 2按下式计算样品中MDA含量 提取液中MDA浓度（卩mol ml 1）x提取液总量（ml） MDA 含量（卩 mol g 1 Fw）= 植物组织鲜重（g） 试剂： 1、 10%三氯乙酸：称取三氯乙酸 55.5556g加水溶解定容至500ml 2、0.6 %硫代巴比妥酸（用10%三氯乙酸配制）：称0.6707g TBA用少量1mol/L氢氧化 钠溶解后加10% TCA溶解定容至100ml （4C贮存

6、） 实验五、SOD活力测定（NBT还原法） 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降 解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近 来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自 由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤， 严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的 自由基主要有超氧自由基（02）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD、烷氧自由基（RO 等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物

7、歧化酶（SOD、过氧化氢 酶（CAT、过氧化物酶（POD和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD等是酶促防御系统的重要 保护酶。抗坏血酸（V。、VE和还原型谷胱甘肽（GSH等是非酶促防御系统中的重要抗氧化 剂。SOD CAT等活性氧清除剂的含量水平和 O2、H2O2 OH.和O2等活性氧的含量水平可 作为植物衰老的生理生化指标。 超氧自由基（O2、是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带 有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果 细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称

8、SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（ O2. ）,生成H2O2 和O2 H2O2由过氧化氢酶（CAT催化生成H2O和O2从而减少自由基对有机体的毒害。 一、原理 超氧物歧化酶（superoxidedismutase ，SOD普遍存在于动、植物体内，是一种清除超 氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT在光下的还原作用来确 定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极 易再氧化而产生O2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在 560nm处有最大吸收。而SOD 可清除O2-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈

9、深，说明酶活性愈 低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 二、试剂 （一）试剂 （1） 0.2 mol/L pH7.8 磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液： A 液（0.2 mol/L NaH2PO4 溶液）：准确称取 NaH2PO4 2H2O （ MW=156.01 15.715g 于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入500mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分 混匀。4 C冰箱中保存备用。 B 液（0.2 mol/L Na2HPO4 溶液）：准确称取 Na2HPO4 12H2O（ MW=358.14 71.63g 于 100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入 1

10、000mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混 匀。4 C冰箱中保存备用。 取上述A液34mL与 B液366mL充分混匀后即为0.2mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。4C 冰箱中保存备用。 （2）0.05 mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液 取0.2 mol/L pH7.8 的磷酸钠缓冲液250mL移入1000 mL容量瓶中用蒸馏水定容至 刻度，充分混匀。4 C冰箱中保存备用。 （3）130mmol/L蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液 准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2SMW=149.21 0.9699g于小烧杯中，用少量0.05 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入 50mL容

11、量瓶中并用0.05 mol/L pH7.8 的磷酸钠缓冲液 定容至刻度，充分混匀（现用现配）。【溶于水，3.3g/100ml 25 C,不溶于有机溶剂】4C保 存可用12d. （4）750卩mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.03066g NBT用磷酸缓冲液定容至50ml，避光4C保 存，先用现配. （5）100 卩 mol/L EDTAr Na2溶液：称取 0.03721g EDTA Na2用水定容至 1000ml【称取 7.442 g EDTA Na2用水定容至200ml，吸取1ml用水定容1000m】 （6） 20卩mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光

12、保存【称取 1.8825g核黄素用少量NaOH溶解并用蒸馏水定容至25ml，吸取1ml用水定容1000ml】。4C 保存8 10天。 三、实验步骤 1. 酶液提取 取植物叶片0.2g0.3g于预冷的研钵中，加2ml预冷的0.05 mol/L pH7.8磷酸缓冲液 在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。于4000rpm下离心15min,上清液即为SOD 粗提液。 2. 显色反应 取试管3支，1支为测定管，另2支为对照管，按下列加入一依次加入各溶液: 名称 样品管 对照管1 对照管2 50mmol/L磷酸缓冲液（ml） 5.0 5.0 5.0 130mmol/L Met 溶液（ml） 0.

13、3 0.3 0.3 750 卩 mol/L NBT 溶液（ml） 0.3 0.3 0.3 100 卩 mol/L EDT Na2液（ml） 1.0 1.0 1.0 去离子水（ml） 2.0 2.0 2.0 20卩mol/L核黄素（ml） 0.3 0.3 0.3 0.3 （酶液） 0.3 （缓冲液） 0.3 （缓冲液） 混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于 4000LX日光下反应20min,然后立即遮光，以 遮光管为对照调零，于560nm下测定光密度。（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低 时延长）O 3.SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。

14、 四、结果计算 已知SOD舌性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算 SOD舌 性。 SOD总活性=（Ack AE）X V/（Ack x 0.5 x W Vt） =（Ack AE）/ （Ack x 0. 015X W） SODt匕活力二SOD总活性/蛋白质含量 上式中：SOD总活性以每克鲜重酶单位表示; 表示 SOD比活力：单位以酶单位/ mg蛋白 Ack:照光对照管的吸光度 AE:样品管的吸光度 V :样品液总体积（ml） Vt测定时样品用量（ml） 实验六、过氧化物酶活性测定 一、试验目的： 过氧化物酶是植物体内普遍存在的活性较高的一种酶，他与呼吸作用、光合作用以

15、及生 长素的氧化等都有密切关系。在植物生长发育过程中他的活性不断发生变化，因此测量这种 酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握常用 的测定过氧化物酶的方法 愈创木酚法。 二、实验原理： 在过氧化物酶催化下，双氧水将愈创木酚氧化成茶褐色产物，此产物在入470nm处有最 大吸收峰，故可以通过测其吸光度的变化测定过氧化物酶的活性。 三、实验试剂 1、0.05 mol/L PH 7.0的磷酸缓冲液： 0.2M A 液（Na2HPO4） 61ml 和 0.2M B 液（NaH2PO4） 39ml 混合 100ml，用去离子 水定容400ml 2、0.05 mol/L

16、愈创木酚溶液：取0.6207g定容100ml 1%愈创木酚溶液：吸取1毫升愈创木酚，加入少量95%酒精溶解，用水定容100ml， 放于棕色试剂瓶中保存备用 3、2%双氧水溶液：取30% H2O2 10ml用去离子水定容150ml 4、反应混合液 取50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0） 30mL，2%过氧化氢10mL，1%愈创木酚10mL混合 四、操作步骤 1 酶液提取：清洗干净叶片擦干，称取 0.20.3 g叶片，剪成小片，放入研钵加入适 量10%WPP（除去酚类物质）、石英沙、及2ml 50mmol的PH 7.0 （5.5-7.5 ）的磷酸缓冲液PBS （0.02-0.1mmol ）进行

17、研磨，磨碎后在加入 8mlPBS容液洗涤研钵一并装入离心管内，4C下 4000rmin-1离心15min,收集上清液4C保存备用。 2 显色反应 类别 对照管 样品管 反应液 3.0 mL 温度 25 C 缓冲液0.5 mL 酶液0.5 mL 测定波长 470nm 五、计算 过氧化物酶活性(厶 OD470/(min.g)= ( A470X VT ) / (W x VSX 0.01 x t) 式中： A470为反应时间内吸光度的变化，W为叶片鲜重g，t为反应时间min，Vt为提取 酶液总体积ml，Vs为测定时取用的酶液体积 ml。 实验19植物组织中可溶性蛋白质含量的测定 I考马斯亮蓝 G -2

18、50染色法 一、原理 考马斯亮蓝 G -250 （ Coomassie brilliant blue， G-250 ）法是利用蛋白质 -染料结 合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔 键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合 后颜色由红色形式转变成蓝色形式， 最大光吸收由465 nm变成595 nm ,通过测定595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2 min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可 稳定1 h，

19、之后，蛋白质染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高（比 Lowry法灵 敏4倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时 线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）试剂 1. 标准蛋白质溶液（100卩/gL牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白25 mg，加水溶解 并定容至100 mL，吸取上述溶液40 mL，用蒸馏水稀释至100 mL即可。 2. 考马斯亮蓝试剂：称取 100 mg考马斯亮蓝 G-250，溶于50 mL 90 %乙醇中， 加入100 mL 85%（ W/V ）的磷酸，再用蒸馏水定容到 1000 mL，

20、贮于棕色瓶中。常温下 可保存一个月。 三、实验步骤 1. 标准曲线的绘制 取6支试管，按表26-1加入试剂，摇匀，向各管中加入5 mL考马斯亮蓝试剂，摇匀， 并放置5 min左右，以0号试管为空白对照，在 595 nm下比色测定吸光度。以蛋白质含 量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 试剂 管号 0 1 2 3 4 5 标准蛋白质（mL ） 0 0.20 0.40 0.6C 0.80 1.00 蒸馏水量（mL ） 1.00 0.80 0.60 0.4C 0.20 0 蛋白质含量（卩g ） 0 20 40 60 80 100 2. 样品测定 1 ）样品提取称取鲜样0.250.5 g，用5

21、mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后， 3000 r/min离心10 min，上清液备用。 （2 ）吸取样品提取液0.3 mL （视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重 复2次），加入5 mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2 min后在595 nm下比色，测定吸 光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量 四、结果计算 式中：C 样品中蛋白质的含虽 查标准曲线值，卩g。 CxFr F.xxlOOO (mg/g ) 14 V T 提取液总体积，mL WF 样品鲜重,g。 V S 测定时加样量，mL 1,考马斯亮蓝G-250所配溶液不稳定，所以每次实验都必须新配，且必须新做标准曲线; 2, 考马斯亮蓝G-2

22、50配制完毕，如果发现溶液中有絮状沉淀，可以试用滤纸过滤后使用, 如果实验中发现使用过滤后的考马斯亮蓝 G-250溶液在与样品接触后短时间内便又发生絮 凝，基本上推测该考马斯亮蓝 G-250过期（比较容易出现）。 实验七、过氧化氢酶的活性测定一一高锰酸钾滴定法 【原理】 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧， 在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定 量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多 余的H2O2 5H

23、2O2+2KMn0 4+4H2SO4 * 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 即可求出消耗的H2O2的量。 【试剂】 【1】3M H2SO4:吸取浓硫酸80ml用去离子水定容至500ml 【2】0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.0; 【3】0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取 KMnO4 （AR） 16 g,用新煮沸冷却蒸馏水配制成 1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定； 0.1mol/L H2O2:市售 30% H2O2大约等于 17.6mol/L,取 30% H2O2溶液 4.87ml，稀释至 500ml，用标准0.1mol/ KMnO 4溶液（在酸性条件下）进行标定；

24、【实验步骤】 1、酶液提取 取叶片0.20.3 g加入2ml pH7.0的磷酸缓冲液少量研磨成匀浆，在加缓 冲液定容转移至10ml后转入离心管中，4000rpm离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提 液。 2.滴定反应 管号 对照管 -样品管 粗酶液（ml） 0.2 0.2 3mol/L H2SO4 (ml) 5 0 PH 7.0磷酸缓冲液 1.8 1.8 0.1mol/L H2O2 (ml) 5 5 条件 加入H2O2立即计时于35C恒温水浴中保温3min 3mol/L H 2SO4 (ml) 0 5 用0.1mol/L KMnO 4标准溶液滴定 H2O2，至出现粉红色（在 30min内

25、不消失）为终点 所用KMnO 4体积（ml） A B 【结果计算】： 酶活(mgH2O2/gFW min)= (A B) Vt 17 FW Vi t 酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示: 式中 A 对照KMnO 4滴定毫升数； B 酶反应后KMnO 4滴定毫升数; Vt 酶液总量（ml）; Vi 反应所用酶液量（ml） 1.7 1ml 0.1mol/L 的 KMnO 4 相当于 1.7mg H2O2。 W样品鲜重（g）; 过氧化氢酶的活性测定紫外吸收法 一、原理 H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240） 随反应时间而降低。

26、根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 二、实验步骤 1、酶液提取 取叶片0.20.3g加入2ml pH7.0的磷酸缓冲液少量研磨成匀浆，在加缓 冲液定容转移至10ml后转入离心管中，4000rpm离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提 液。4C下保存备用。 2. 测定：取10ml试管3支，其中1号为样品测定管，1号为空白管，按表40-2顺序加入 试剂。 表40-2 紫外吸收 攵法测定H2O2样品液配置表 管号 样品管 对照管 粗酶液（ml） 0.2 （煮死酶液）0.2 pH7.0 磷酸(ml) 1.5 1.5 蒸馏水（ml） 1.0 1.0 25 C预热后，逐管加入0.5ml

27、 0.1mol/L 的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min,待3支管全部测定完后, 按下式计算酶活性。 3. 结果计算： 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 过氧化氢酶活性（u/gFW/min）= 式中 .-：A240 = Aso (Asi 亠 As2) A240 VT 0.1 Vi t FW Aso加入煮死酶液的对照管吸光值; AS, AS 样品管吸光值； V1 测定用粗酶液体积（ml）; Vt 粗酶提取液总体积（ml）; FW 样品鲜重（g）; 0.1 A240每下降0.1为1个酶活单位（u

28、）; t加过氧化氢到最后一次读数时间（min） 高锰酸钾滴定液的配制和标定 1高锰酸钾滴定液（0.1mol/L）的配制 市售高锰酸钾常含有少量 MnO2等杂质，蒸馏水也常有微量的灰尘，溶液在配制初期不 够稳定，浓度常降低，因此高锰酸钾溶液不能用直接法配制，所以先配制成近似所需的浓度。 【1】方法：称取稍多于理论用量的固体高锰酸钾，用 新煮沸并冷却的蒸馏水 溶解，放置 两天以上或加热至沸，并保持微沸15min，使各种还原性物质完全氧化，用垂熔玻璃器过滤， 除去MnO2等沉淀，摇匀，储存于 棕色瓶中，暗处密闭保存。 【2】操作步骤：称取高锰酸钾16g，加蒸馏水1000ml，煮沸15mi n、放冷，转人棕色瓶 中密闭避光保存，2天后过滤待标定。 2高锰酸钾滴定液（0.1mol/L）的标定 基准物：Na2C2O4 在硫酸（0.5Imol /L）溶液中，加热至7585C时反应如下： 2MnO/+ 5C2O4 + 16H+ 2Mn2+ 10CO2 T+ 8H2O 但溶液温度低于60C，反应速度较慢，如温度高于90C时，则草酸钠会分解，使测定结 果偏咼。 操作步骤：称取恒重的基准物Na2C2O4约