脊髓伤后脊髓组织一氧化氮合酶活性的动态变化及其意义

1、如果对您有帮助！感谢评论与分享 脊髓伤后脊髓组织一氧化氮合酶活性的动 态变化及其意义 导读：本文脊髓伤后脊髓组织一氧化氮合酶活性的动态变化及其意义 仅供参考，如果觉得很不错，欢迎点评和分享。 一氧化氮 (Nitric oxide, NO) 是由一氧化氮合酶 (Nitric oxide synthase, NOS) 催化左旋精氨酸 (L-arginine, L-Arg) 而产生， 在生物 体内具有广泛而多样的生物学效应， 在生理状态下能传递信使、 调节 血管张力；在病理状态下参与脑缺血损害，具有神经毒性作用 1 。 然而它在脊髓损伤中的作用尚不清楚。 由于 NO 半衰期极短， 难以直 接测定 ,

2、加之它在体内不能贮存，所以本实验通过测定大鼠脊髓压迫 伤后 NOS 活性的动态变化来间接反应 NO 的变化规律， 以利于进一 步探讨 NO 与脊髓继发性损伤的关系。 1 材料与方法 1.1 实验动物与分组 健康、封闭群 SD 大鼠 42 只 ,体质量 (280 士 30)g随机分为假手术组及根据后路压迫伤后取材的时间分为 0、5、10、20、30 和 60min 组，每组 6 只。 1.2 试剂及器材 L-2,3,4,5-3H-arginine 、Dowex AG50w-X8 、 NADPH 、钙调蛋白均购自 Sigma 公司 ,其余试剂为国产 AR 级。 Megafuge1.0R 低温离心机

3、为日本产品， Beckman LS5000 CE 液体 闪烁仪为美国产品， CPS-1A 超声波粉碎机为上海超声波仪器厂产品。 1.3 方法 1.3.1 动物模型的制备动物用 1% 戊巴比妥钠 30mg/kg 腹腔注射 医学专用，取后正中切口，切除T 810椎板，暴露脊髓，按Nystrom 方法2后路压迫脊髓 (35.0g/10min) 。假手术组仅行脊髓暴露而不致 伤。 1.3.2 脊髓标本的采集 按分组时间要求处死动物后 ,立即浸入冰 水中，取伤段脊髓或相应部位脊髓置于冰冷的 HEPES 缓冲液中 (20mmol/L , pH7.4)，匀浆，超声粉碎。立即置于 4 C低温离心机 中离心(1

4、5000r/min x 30min)。 1.3.33HCitrulline 检测 将上述 25ml 上清液加于含有 2mmol/L NADPH 、0.5mmol/L CaCl2 、10 g/L 钙 调蛋白 的 50mmol/L HEPES 缓 冲 液 中 ， pH 为 7.4 。 然 后 加 入 25ml3HL-arginine (25m ci/25 m l),置于 24 C恒温水浴箱中 30min 。立即加入含有 2mmol/LEDTA 的 20mmol/L HEPES 反应 停止液中，过 Dowex AG 层析柱，于 Beckman 液闪仪中测定 3H-citrulline 的放射活性。

5、1.34 蛋白含量的测定采用改良 Lowry 法3 测定蛋白含量。 1.3.5 NOS 活性表示 NOS 活性表示为每分钟每毫克蛋白形成的 3H-citrulline 的量。创伤后各时相 NOS 活性以与假手术组相比而 得的相对值表示。 1.3.6 统计学处理采用 F 检验和 t 检验进行统计学处理。 2 结果 脊髓压迫伤后即刻，伤段脊髓组织 NOS 活性升高到正常脊髓的 1.42 倍，有显著差异 (P0.01); 压迫伤后 5 min 达最高点，为正常 脊髓组织 NOS 的 3.24 倍；之后迅速下降，至伤后 60min ，伤段脊 髓组织 NOS 活性基本接近正常 (P0.05 ，) 3 讨

6、论 脊髓损伤包括原发性和继发性损伤。 脊髓原发性损伤后引起了一 系列级联放大的生化物质改变， 从而造成了不可逆的继发性结构损害。 现已发现许多因素都参与脊髓创伤后继发性损伤过程， 诸如兴奋性氨 基酸、单胺、神经肽、血小板活化因子等。然而通过逆转或阻止这些 因素的变化并未能有效地阻断继发性脊髓损伤的发生。 这可能是由于 脊髓创伤后继发性损伤的发生是多因素参与的复杂过程， 对其病理生 理过程的认识尚不够深入，未能找到阻止其发生、发展的根本环节。 近年来，人们认识到 NO 是一种机体内无处不有的小分子物质， 具有 广泛而多样的生物效应。 为探讨其在脊髓创伤中的作用， 本实验根据 NOS 催化同位素标

7、记的 L-Arg 生成同位素标记的瓜氨酸 (L-citrulline) 和 NO 的原理， 首次动态地观测了大鼠脊髓压迫伤后 NOS 活性的变 化。结果发现脊髓压迫伤后 NOS 活性迅速升高，伤后 5 min 达最高 点，此后又迅速下降，伤后 60 min 恢复至正常水平。脊髓压迫伤后 NOS 活性迅速而短暂升高 ,说明机体具有调节 NOS 活性的内在机制， 然而目前对其调节的确切机制尚不清楚 ,可能有如下因素参与： (1) 对 缺血刺激的直接反应。 NO 的主要功能之一是调节血管张力和抗血小 板粘附与聚集。 在脑组织中， NO 是调节血流的主要介质 ,脑缺血后导 致了结构性 NOS 活性迅速

8、升高 4 。在脊髓组织中 , NO 可能存在着 同样的作用 ,当脊髓受压时导致局部缺血 ,从而需要大量的 NO 来维持 局部血供 , 以达到内环境的稳定。 (2) 结构性 NOS 是钙依赖性酶，而 脊髓损伤后可导致大量的钙离子细胞内流5。(3)N0S的磷酸化与脱 磷酸化。 Bredt 等发现脑 NOS 有两个基团，能被不同的蛋白激酶磷 酸化，导致 NOS 活性下降6。脊髓创伤后缺血可使 ATP 迅速消耗 而引起 NOS 脱磷酸，也将会导致 NOS 活化。 (4)底物及辅助因子对 NOS活性的影响。NOS催化底物L-Arg和02反应需要大量的还原 性辅助因子，如底物不足或缺少辅助因子 ,都将会影响反应的进行。 脊髓损伤后由于 N0S 活性迅速升高使底物及辅助因子大量消耗，从 而导致 N0S 活性下降。 (5)反应产物对 N0S 活性的影响。 N0 具有 强氧化性，能使 N0S 的巯基亚硝酰基化，从而使 N0S7 失活。另 外，N0尚能氧化NMDA受体中关键的巯基群，从而减少钙内流，降 低 N0S 的活性8。 脊髓损伤后 N0S 活性早期迅速升高的意义何在， 目前尚不清楚。 一方面可