HPLC测定富马酸福莫特罗原料的有关物质

1、HPLC测定富马酸福莫特罗原料的有关物质摘 要：建立HPLC法测定富马酸福莫特罗的有关物质。 所有验证结果均符合中国药典 2010 年版二部附录 XIX A 药品质量标准分析方法验证指导原则的相关要求。关键词：高效液相色谱法；富马酸福莫特罗；有关物质富马酸福莫特罗是一种长效B 2受体激动剂，具有长效，高选择性，副作用小的显著特点，临床上广泛用于哮 喘。本实验参照 USP37的色谱条件，建立 HPLC测定富马酸 福莫特罗有关物质的方法。1 仪器和试药美国Waters e2695高效液相色谱仪：2489紫外检测器， A10707051Z 四元泵，A105CH251G 柱温箱，Empower 3 色

2、谱 工作站，KQ5200B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）. 富马酸福莫特罗工作对照品：自制（滴定纯度99.9%），杂质G、A、C、E对照品由上海医药工业研究院提供。乙腈为色 谱纯，其他试剂为分析纯，水为制药用注射用水。2 方法和结果2.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱：采用 Agilent，ZORBAX SB-C8 column（150 mm x 4.6 mm , 5 um）, 称取 4.212g二水磷酸二氢钠，加水 1000ml溶解并混匀（加磷酸调节PH为3.1 0.1 ）为流动相A,乙腈为流动相 B,流速 1.0ml/min，检测波长为 214nm，柱温：25C,进样量：20u

3、l, 理论塔板数按福莫特罗峰计算不低于 2000。2.2 稀释剂溶液的配制 稀释剂： 含 0.037mol/L 磷酸二氢 钠和 0.005mol/L 磷酸氢二钠的水溶液， pH 为 6.0 0.1） -乙 腈（84： 16）2.3 空白干扰试验 取制药用注射用水为空白溶液， 精密 进样20ul，记录色谱图。2.4 系统适应性溶液的配制 称取富马酸福莫特罗对照 品和富马酸福莫特罗杂质 C 对照品适量，加稀释剂溶解并稀 释制成每1ml中约含富马酸福莫特罗 200卩g以及富马酸福 莫特罗杂质C0.4卩g的系统适用性溶液，量取 20卩l注入液 相色谱仪，记录色谱图。2.5样品溶液的配制 富马酸福莫特罗

4、样品 20mg，精密 称定，置100mL量瓶中，加稀释剂约 50mL,超声溶解。放 冷至室温，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，配成 0.2mg/mL 的 样品溶液。2.6 专属性试验 考察空白溶剂或其他有关物质存在情 况下，样品中有关物质的测定是否受到干扰。2.6.1 空白溶剂、 富马酸福莫特罗系统适用性溶液、 样品 溶液均按照方法描述配制。在方法规定的色谱条件下进样， 并记录色谱图。2.6.2 空白溶剂在富马酸福莫特罗及其各有关物质出峰 处没有干扰。各峰与各待测杂质之间，各峰与主峰之间的分 离度均大于 1.5，且主峰与杂质 C 的分离度大于 1.5，各待 测杂质之间的分离度也同样大于1.5。2.7

5、 线性范围试验2.7.1 制备富马酸福莫特罗及杂质G、A、 C、E 对照品配制成 0.2mg/mL 的储备溶液。精密移取富马酸福莫特罗储 备溶液、杂质 E 对照品储备溶液、杂质 G 对照品储备溶液 各1ml、杂质C对照品储备溶液2ml、杂质A对照品储备 溶液3mL,稀释500倍制成线性测试对照品混合储备溶液。2.7.2 结果：富马酸福莫特罗峰面积对浓度的线性回归 方程为 y = 86.573x - 0.1523，线性相关系数 r= 0.999 ， Y 轴 截距值小于定量限响应值的 50%；结果显示该方法在各限度浓度的QL150%的浓度范围内响应值与浓度呈现良好线性，线性范围满足要求。2.8 准

6、确度试验2.8.1 按照规定的方法制备样品溶液； 制备杂质限度水平 的 50%、 100%和 150%水平的杂质储备溶液，每个水平平行制备三份，并用上述杂质储备溶液作为溶剂，制备成杂质浓 度分别为限度水平的 50%、 100%和 150%水平的九份样品溶 液。在方法规定的色谱条件进样 。2.8.2 在富马酸福莫特罗原料药杂质限度水平的50%、100%、150%三个浓度下，分别计算各有关物质的回收率， 考察方法的准确度，回收率结果显示：杂质 G 在 9 份样品 的回收率均在 80.0%120.0%范围内，平均回收率为 110.1%， RSD 为 1.2%。2.9 精密度试验2.9.1 重复性试验

7、按照规定的方法计算单个有关物质的量，并计算其制备 的六份样品的 RSD结果显示6份样品中，各杂质的量 RSD% 不大于 10 %。2.9.2 溶液稳定性试验 取重复性加入各有关物质的样品溶液。在 0 天进行测 定，按照规定的方法计算单个有关物质的量。将上述样品溶 液分装成两份，一份储存于室温下，另一份储存于4C下，分别于 1 天、2 天进样，计算单个有关物质的量。 结果显示： 单个有关物质的量差值应不超过0.05 %。表示溶液稳定性良好。2.9.3 样品检验 对制备的 3 批富马酸福莫特罗样品，按 上述方法进行了配制，参照色谱条件进行有关物质测定并计 算各杂质限度，结果见下表。3 讨论试验参照了 USP37、BP2010 及 EP 7. 0中测定富马酸富莫 特罗有关物质所用的 HPLC方法及有关资料，通过多次试验， 最终确认以称取 4.212g 二水磷酸二氢钠，加水 1000ml 溶解 并混匀（加磷酸调节 PH为3.1 0.1 ）为流动相A,乙腈为流 动相B,流速1.0ml/min，检测波长为214nm，采用梯度洗脱。 在此条件下，各杂质峰分