(完整版)质粒DNA的提取、纯化与鉴定

1、分子生物学实验报告 题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定 姓名： 学号： 班级： 时间： 一、实验目的： 1. 学习并掌握凝胶电泳进行 DNA的分离纯化的实验原理。 2. 学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3. 学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4. 掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5. 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 二、实验原理： 1. 质粒DNA的提取一一碱变性提取法： 提取和纯化质粒DNA勺方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸 法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和 Wizard法等。其中， 碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒 DNA勺提取

2、。该方法操作简 单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒 DNA纯度高，可直接用于酶 切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质 量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质 粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提 取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含 有RNA但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。 碱变性法提取质粒DNA-般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质 粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒 DNA。 在细菌细胞中，染色体 DNA以双螺旋结构存在，质粒

3、 DNA以共价闭合环 状形式存在。细胞破碎后，染色体 DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变 性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色 体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分 氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用 pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐 溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超 螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体 DNA不能复性，而是与不稳定的大分子 RNA蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉 淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒 DNA分离。溶于上清的质粒 D

4、NA可 用无水乙醇和盐溶液，减少 DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形 成沉淀。由于DNA与 RNA生质类似，乙醇沉淀DNA勺同时，也伴随着RNA沉 淀，可利用RNase A将 RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶 性蛋白，可通过酚 / 氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒 DNA。 2. 凝胶电泳进行DNA分离纯化： 电泳(electrophoresis) 是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极 方向移动的现象。各种生物大分子在一定 pH 条件下，可以解离成带电荷的 离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛 效应。含有电解液的凝胶在电场

5、中，其中的电离子会发生移动，移动的速度 可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可 以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化 DNA 片段，是分子生物学的核心技术之一。 凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。此外，凝胶中 DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭 (ethidium bromide , EB) 或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至 20pg的双链DNA在紫外激发 下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用 于各种各样目的的实验。 分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖 (agar

6、ose) 和聚丙烯酰胺凝胶。 这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位 进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸 (5 500bp)的分 离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差 1bp 或质量上相差 0.1% 的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 DNA序列分析 的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA1样量，但是 与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状 多聚物，由B -D-吡喃半乳糖与3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质 量为104-105。琼脂糖加热至90C左右，即可溶化形成

7、清亮、透明的液体， 浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40-45 C。琼脂糖凝胶相对于聚丙 烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大(50至百万bp)，小片段 DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶 内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA勺相对 分子质量，分离经限制酶水解的 DNA片段，进一步纯化DNA等。 琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带 有负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取 决于6个因素：样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳 所用电场、缓冲液和

8、温度。 三、主要仪器和材料试剂： 1. 仪器和材料： 恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，旋涡振荡器，水浴锅，1.5mL离心管， 50mL离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽， 电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯， Eppendorf 管等。 菌体：E.coli DH5a受体菌，具有 Amp标记的质粒pUC19 2. 实验试剂： LB培养基，抗生素(氨苄青霉素)，溶液I,溶液U,溶液川，RNase A 母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇(PCI) 混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液(10X)，上样缓冲液(6X)， 琼脂糖，溴化乙锭(E

9、B),DNA相对分子质量标准物 DNAMarker入/Hind IH， 5mol/L pH 5.2 的醋酸钠。 四、实验步骤： 1. 菌体培养： (1) 配制40mL液体LB培养基(加入 5%葡萄糖)、100mL固体LB 培养基、并准备足量的移液管、200卩1微量移液器头、1000卩1 微量移液器头、50mL离心管、1.5mL离心管，灭菌备用。 (2) 向液体LB培养基移取32卩1氨苄青霉素，混合均匀。 (3) 将提前活化的E.coli DH5x受体菌，接种于液体LB培养基中。 将锥形瓶放入恒温震荡培养箱中，37C, 200r/min培养12-16h 2. 质粒DNA勺提取： (1) 称量50

10、mL离心管重量 W1取30mL菌液于已称重的 50mL离心 管中，配平后 6000r/min离心5min。 (2) 弃上清，向离心管中加入5mL溶液I,涡旋振荡，6000r/min 离心5min。 (3) 弃上清并称重 W，求 W=WW。 (4) 按照1.0mL/100mg菌体的量加入溶液I,充分涡旋振荡，冰浴 5min，再按照2.0mL/100mg菌体的量加入溶液U,温和颠倒混 匀，冰浴2min，然后再按照1.5mL/100mg菌体的量加入溶液 川，温和颠倒混匀，冰浴10min，平衡后12000r/min离心15min。 (5) 取上清至新50mL离心管内，记录体积，加入两倍体积的冰乙 醇，

11、混匀后在-20 C环境下保存 30min。取出后12000r/min离 心15min，弃上清，加入5mL703乙醇，12000r/min 离心5min， 弃上清，加入 5mL70汇醇，12000r/min 离心5min，弃上清， 37 C放置 5-10min。 (6) 取出离心管，加入 ImLTE溶液得到粗提物，加入RNase A 液, 使溶液浓度为 150卩g/mL , 37 C保存60-120min。 3. 质粒DNA勺纯化： (1) 取500卩l粗提物于1.5mL离心管中，加入等体积的Tris饱和酚， 混匀，12000r/min 离心 10min。 (2) 转移上清(体积V)至新管，加入

12、等V1的酚：氯仿：异戊醇溶液， 混匀，12000r/min 离心 5min。 (3) 转移上清(体积V0至新管，加入等 V2的氯仿：异戊醇溶液，混 匀，12000r/min 离心 5min。 1 (4) 转移上清(体积V3)至新管，加入10 V3的3MNaAc溶液(pH5.2), 1 再加入2V4 ( VfV+局V3)的冰乙醇，混匀，-20 C保存30-60min , 取出后 12000r/min 离心 15min。 (5) 弃上清，加入 500卩l 70%乙醇，10000r/min 离心2min,再加入 500 卩 l 70% 乙醇，10000r/min 离心 2min, 37C保存 5-1

13、0min。 (6) 取出离心管，向一只离心管中加入 25卩l TE溶液，溶解沉淀后， 转移入另一只离心管中，再取25卩l TE溶液加入第一只离心管中， 溶解后再移入另一只离心管中，得到50卩l纯化质粒DNA 4. DNA纯度检测： (1) 取40mLTA(1X)于300mL锥形瓶中，加入0.4g琼脂糖，放入微 波炉内使其熔化，60C时倒入准备好的制胶槽中。 (2) 取5.0卩l纯化DNA加入1.0卩l上样缓冲液，混合，进行点样。 (3) 点样完毕后，100V, 200mA条件下电泳 30min。 (4) 电泳完毕后，进行 EB染色，用凝胶成像仪拍照，得到实验结 果。 五、实验结果： 凝胶成像仪

14、拍照如下: 图1 DNA纯度检测凝胶成像结果 (1号泳道：DNA marker入/Hind川；2号泳道：超螺旋 状态的pUC19质粒DNA 3号泳道：线性的 pUC19质粒DNA 4号泳道：空泳道；5至9泳 道：7至11组pUC19质粒DNA羊品；10号泳道：入DNA 本组点样在第9泳道，照片显示各种杂质去除得较为彻底，得到了较高 纯度的超螺旋状态的pUC19质粒DNA 六、讨论： 1. 为获得高纯度的质粒DNA必须彻底去除杂蛋白、染色体 DNA和RNA在 整个质粒提取过程中出去染色体 DNA的关键步骤是加入溶液U、溶液川 的变性和复性环节，应控制好变性和复性的时机。加入溶液I时，可剧 烈震荡

15、，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体 不会断裂；加入溶液U时，菌液变粘稠、透明，无菌块残留；加入溶液 川时，会立即出现白色沉淀。加入溶液U和溶液川后，应缓慢上下颠倒 离心管数次，切忌在旋涡振荡器上剧烈振荡，否则染色体DNA会断裂成 小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利 于质粒DNAS纯。因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法， 既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。 2. 酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到 酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。 3. 为最大限度去除上清，可在倒掉部分上清

16、后，再将离心管放入离心机稍 作离心，使残留在管壁的液体集中到离心管底部，再用移液器移除液体。 4. 注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也 不要快速按出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。 5. 本次实验中，原应灭菌之前加入培养基内的葡萄糖由于操作疏忽而忘记 加入，随后按照老师指示配制100mL10%勺葡萄糖溶液一起灭菌，待灭菌 后再将葡萄糖溶液加入培养基中。 6. 培养菌体所用勺 1 4个锥形瓶有 2个锥形瓶中没有菌体生长迹象， 另外有 2 个锥形瓶内菌体生长较少。 原因可能是接种时操作失误， 例如可能是接 种环挑取菌种后离酒精灯火焰太近或者挑取菌种前没有充

17、分冷却，也有 可能是接种时接入勺菌量过少等。 7. 在纯化DNA加入冰乙醇的步骤中，2只离心管在加入的DNA羊品量相同的 情况下，出现了从-20 C环境下取出后2只离心管内液体体积相差较多的 情况，分析后发现量较少的 1 只离心管内加入的各种试剂的量是合适的。 可能的原因：在用移液器移取冰乙醇时下按力度太大，吸入过多液体； 2 只离心管分别由 2 名组员加液，操作上可能出现个人之间的误差。 8. 本次实验得到的质粒DNA较少，最主要原因是选择了菌体生长较少的培 养基，仅得到较少的粗提物，导致最终纯化得到的质粒DNA也较少。 七、附注： 培养基及实验试剂配方： 1. LB(Luria Broth

18、 )培养基 LB液体培养基：1%蛋白胨(typtone )，0.5%酵母粉(yeast extract )， 1%NaC。用 NaOH调 pH至 7.2, 121 C灭菌 20min备用。 LB固体培养基：除以上LB培养基成分外，还需要添加1.5%2嘛脂， 121C灭菌20min备用。 LB半固体培养基：在 LB液体培养基中加入 0.75%琼脂，121 C灭菌 20min 备用。 2. 氨苄青霉素：母液浓度为100卩g/卩l，工作浓度为50100卩g/mL。 3. TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCI(pH 8.0)，1mmol/L EDTA 4. 氯仿/异戊醇混合液：按氯仿：异戊醇为24： 1 (V/V)的比例在氯仿中加 入异戊醇。 5. 酚/氯仿/异戊醇(PC