克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用

1、分子和细胞遗传学异常分子和细胞遗传学异常 抗原受体基因的克隆性重排抗原受体基因的克隆性重排 与类型相关的染色体异常 l简要原理简要原理 l检测方法检测方法 l应用和策略应用和策略 l注意事项注意事项 淋巴细胞表面受体淋巴细胞表面受体 l IG： IGH （14q32) IGL (2q12) (22q11) l TCR: TCR 14q11 TCR 7q32 TCR 7p15 TCR 14q11.2 IG和和TCR基因结构及重排过程基因结构及重排过程 胚 系 可变区恒定区 胚系 D-J重排 V-D-J重排 转录与拼接 各区片段数多各区片段数多 重排的多样性重排的多样性 抗体多样性抗体多样性 IG

2、H IGKIGLTCRATCRBTCRGTCRD V V664338464768 D D277656546798 J J655611354 淋巴细胞发育过程中基因重排顺序淋巴细胞发育过程中基因重排顺序 IG: H重排: IgH/ 缺失 ： IgH/ TCR: ：TCR ：TCR 淋巴瘤中基因重排形式淋巴瘤中基因重排形式 克隆性重排克隆性重排 不同的淋巴细胞 相同的重排形式 淋巴细胞单克隆性增生 淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标 克隆性重排的检测方法克隆性重排的检测方法 Southern 杂交 PCR法 特异性探针： 胚系的特征性片段外 另一不同大小的片段 South

3、ern 杂交 优点： 敏感性较高 可靠性高 缺点： DNA量多（10ug) 新鲜组织 操作复杂 时间长、成本高 放射性同位素 逐渐被PCR方法替代 PCR法 原理原理: VDJ重排 后相互靠拢，用适当的引物可扩增 出重排片段 新鲜、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本， 不受DNA片段的影响，仅需要少量的DNA， 时间短，敏感性高， 是目前最常用的克隆性重排的检测方法。 引物的选择原则引物的选择原则 l引物位置：PCR产物长度10-15bp l引物本身的长度0.05) 表明TCR基因重排在LyP和CALCL的鉴别中无应用价值。 必须结合临床病史必须结合临床病史 Ig和和TCR基因重排不一定是谱系的

4、标志：基因重排不一定是谱系的标志： 某些某些T、B淋巴瘤有基因重排的交叉淋巴瘤有基因重排的交叉 T,B之间：不成熟的T或B相对频繁 TCRab, TCRrd之间 前前T细胞性白血病细胞性白血病/细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤几乎所有都存在几乎所有都存在TCR克隆性重排，但大克隆性重排，但大 约约20%同时伴有同时伴有IGH基因重排基因重排 前B细胞性白血病/淋巴瘤，非特殊类型均有IGH DJ 区克隆性重排 70% 存在TCR， 重排对谱系鉴定无帮 助 毛细胞白血病共同表达多克隆性IG亚型，认为存在多 点亚型转换阻滞 T细胞大颗粒淋巴细胞白血病TCR，TCR克隆性重排，存在TCR， TCR交叉 NK细胞慢

5、性淋巴细胞增生异常没有IG和TCR克隆性重排 侵袭性NK细胞白血病没有IG和TCR克隆性重排 结外NK/T 细胞淋巴瘤，鼻型大多IG及TCR无重排，少数因存在反应 性细胞毒性T细胞导致TCR克隆性重排 肝脾T细胞淋巴瘤TCR克隆性重排 来源的存在等位的TCR克隆性重排 来源的一部分存在TCR克隆性重排， 一部分未产生TCR克隆性重排 蕈样霉菌病蕈样霉菌病部分存在部分存在TCR克隆性重排克隆性重排 原发性皮肤CD30+T细胞淋巴增生性 疾病 60%存在TCR克隆性重排，TCR克隆 性重排与淋巴瘤相关 原发皮肤T细胞TCR克隆性重排；TCR克隆性重 排可能存在或缺失，但不表达 血管免疫母细胞性T细

6、胞淋巴瘤75-90%：TCR克隆性重排 25-30%：IG克隆性重排，与EBV+B 细胞相关 间变大细胞淋巴瘤，ALK+90%存在TCR克隆性重排与是否表 达T细胞抗原无关，10%不存在IG和 TCR克隆性重排 间变大细胞淋巴瘤，ALK-多数存在TCR克隆性重排与是否表 达T细胞抗原无关 肠病型T 细胞淋巴瘤（EATL）TCR，TCR克隆性重排在各种形 态学亚型均存在 T细胞幼淋巴细胞白血病TCR、TCR克隆性重排 (1) 少量淋巴细胞 (2) 小标本或高负荷B细胞淋巴瘤中有少量反应性T细胞 (3) EBV或CMV感染 (4) 免疫抑制患者 (5) 淋巴结或外周血中TCR的某些组分重排占优势,

7、重排多样性受限 制,可出现寡克隆信号。 假克隆和寡克隆信号表现：弱条带或两条以上条带假克隆和寡克隆信号表现：弱条带或两条以上条带 辨别方法：辨别方法： 多次重复，大小不同的条带多次重复，大小不同的条带 只有那些可重复的相同大小的条带是可信的单克隆性条带只有那些可重复的相同大小的条带是可信的单克隆性条带 3. 假克隆和寡克隆假克隆和寡克隆 4.淋巴瘤重排检出率不是淋巴瘤重排检出率不是100% 假阴性假阴性 原因： （1）早期未完成重排；有些类型淋巴瘤缺乏 基因重排 （2）引物不全 （3）与其他基因重排、突变； （4）体细胞超突变(eg. MCL vs FL) （5）检测敏感性限制 （6）所用检测

8、技术分析技术 （7）不合适的退火温度 解决办法：多组引物组合，仔细分析解决办法：多组引物组合，仔细分析 仅用一对引物时 滤泡性淋巴瘤滤泡性淋巴瘤IG重链和轻链重排；由于其可变区存在大量的体细胞突重链和轻链重排；由于其可变区存在大量的体细胞突 变，导致单对引物不易扩增出单克隆产物（变，导致单对引物不易扩增出单克隆产物（10-40%）。）。 多重多重PCR(BIOMED-2)引物可以检测出引物可以检测出90%的的IGH(V-D- J)基因重排，用此引物可以检测出基因重排，用此引物可以检测出100%IGH(D-J)和轻和轻 链基因重排链基因重排 慢性淋巴细胞性白血病/ 小淋巴细胞性淋巴瘤 40-50

9、%未突变的病例中存在IG基因重排，在未突变的病 例BCR的意义非常重要，常和自身抗体反应相关 幼B淋巴细胞白血病50%：IG未突变的重链克隆性重排。所有病例具有VH3 （68%）和VH4（32%）基因家族 MALT淋巴瘤IG重链，轻链重排以及可变区体细胞突变 结内边缘带淋巴瘤VH3和VH4家族明显突变的IG基因克隆性重排 儿童结内边缘带淋巴瘤IG基因克隆性重排在区别该病和反应性增生作用大 原发皮肤滤泡中心淋巴 瘤 具有体细胞高突变的克隆性IG重排，但有些不能被PCR 检测到 套细胞淋巴瘤IG克隆性重排，可变区基因大多未突变，但15-40%存在 低量的突变。 弥漫性大弥漫性大B细胞淋巴瘤非特殊类

10、型细胞淋巴瘤非特殊类型可检测到可检测到IG重链和轻链的克隆性重重链和轻链的克隆性重 排排 可变区存在体细胞高突变可变区存在体细胞高突变 富于T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴 瘤 肿瘤B细胞存在IG克隆性重排，IG存 在体细胞突变和生发中心的细胞一致。 5假阳性：假阳性： 技术原因；PCR法影响因素多，严格分区 各种原因所致的假克隆或寡克隆 产物分析区产物分析区 空气流向空气流向 空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向 缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间 专用走廊专用走廊工作流向工作流向 扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区 产物分析区产物分析区 空气流向空气流向 空气

11、流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向 缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间 专用走廊专用走廊工作流向工作流向 扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区 设计A 设计B 专门人员：完善技术和内容专门人员：完善技术和内容 专门空间：防止污染专门空间：防止污染 结果分析：注意可能的陷阱，必要时重复结果分析：注意可能的陷阱，必要时重复 综合判断：结合形态、免疫表型和病史综合判断：结合形态、免疫表型和病史 谢谢 谢谢 ! 特异性探针： 胚系的特征性片段外 另一不同大小的片段 Southern 杂交 优点： 敏感性较高 可靠性高 缺点： DNA量多（10ug) 新鲜组织 操作复杂 时间

12、长、成本高 放射性同位素 逐渐被PCR方法替代 PCR法 原理原理: VDJ重排 后相互靠拢，用适当的引物可扩增 出重排片段 新鲜、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本， 不受DNA片段的影响，仅需要少量的DNA， 时间短，敏感性高， 是目前最常用的克隆性重排的检测方法。 引物的选择原则引物的选择原则 l引物位置：PCR产物长度10-15bp l引物本身的长度25bp l精确地将所有VDJ基因片段捡出 l家族性引物或通用引物 l不同的组合具有互补性，提高阳性率 l引物数目和同源性之间平衡 对照的设立对照的设立 2007-01-04 control and 1 17F, 右颈淋巴结肿大 内 FR1 FR2 FR3 - + - + - + - + CD20 Bcl-2 3. 组织小或无法取得组织病变的诊断 深部肿块的穿刺或活检标本如胃镜标本 无明显肿块，仅表现为胸腹水 但要特别注意细胞的量 52M ， 左眼内吸取物 细胞涂片检查：见恶性肿瘤细胞，小圆细 胞肿瘤，倾向淋巴瘤 基因重排