基因重组方法=全

1、3、基因重组 基因重组（gene recombinationgene recombination）是两个独立基因组内 的遗传基因，通过交换与重新组合形成新的稳定基因组 的过程。 原核微生物基因组 通常只是部分遗传物质的转移和重 组，并且通过转化、接合和转导等形式进行； 真核微生物的基因重组 发生在有性繁殖过程中，通过 减数分裂后整套染色体发生高频率交换（基因重组） 在真核微生物中的部分真菌存在不通过减数分裂而在有 丝分裂过程产生低频率基因重组的准性生殖方式 细菌的三种水平基因转移形式 接合 转导 自然转化 3.13.1 原核生物的基因重组 接合 (conjugation)(conjugatio

2、n)： 细胞与细胞的直接接触（由F F因子介导） 转导(transduction)(transduction)： 由噬菌体介导 自然遗传转化(natural genetic transformation)(natural genetic transformation)： 游离DNADNA分子 + + 感受态细胞 3.1.1细菌的接合作用(conjugation) 通过细胞与细胞的直接接触而产生的 遗传信息的转移和重组过程 (1).实验证据 1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 细菌的多重营养缺陷型杂交实验 （参见 P 215） 中间平板上长出的原养型菌

3、落 是两菌株之间发生了遗传交换 和重组所致！ 证实接合过程需要细胞间的直接接触的 “U”型管实验（ Bernard Davis，1950 ） (2) (2) 机制 ( (大肠杆菌的接合机制) ) 接合作用是由一种被称为F F因子的质粒介导 F F因子的分子量通常为5 510107 7，上面有编码细菌产生性菌毛 （sex pilisex pili）及控制接合过程进行的2020多个基因。 含有F F因子的细胞：“雄性”菌株（F F+ +），其细胞表面有性菌毛 不含F F因子的细胞：“雌性”菌株（F F- -），细胞表面没有性菌毛 F F因子为附加体质粒 既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（

4、整合）到染色体上 F F因子的四种细胞形式 a a）F F- -菌株， 不含F F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收 F F因子而变成雄性菌株（F F+ +）； b b）F F+ +菌株， F F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。 c c）HfrHfr菌株，F F因子插入到染色体DNADNA上，细胞表面有性菌毛。 d d）FF菌株，HfrHfr菌株内的F F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F F因子，特称为FF因 子。 细胞表面同样有性菌毛。 1 1） F F+ +F F- -杂交 杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F F+ +细胞 理化因子的处理可

5、将F F因子消除而使F F+ +菌株变成F F- -菌株 F F+ +菌株的F F因子向F F- -细胞转移，但含F F因子的宿主细胞 的染色体DNADNA一般不被转移。 Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移 过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组 ，由此而得名为高频重组菌株。 2）Hfr F-杂交 Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F- 细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生 缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细 胞转移，F因子除先导区以外，其余

6、绝大部分是处于转移染色体的末 端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故 HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。 染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会 就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。 F因子不易转入受体细胞中，故HfrF- 杂交后的受体细胞（或称接合子）大多 数仍然是F-。 3）FF-杂交 Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子， 特称为F因子。 FF-与F+F-的不同：给体的 部分染色体基因随F一起转入受体细胞 a）与染色体发生重组； b）继续存在于F因子上， 形成一种部分二

7、倍体； 细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导 （F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediated transduction）。 3.1.2 细菌的转导（transduction） 由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式： 一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中 能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA 带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体 细菌转导的二种类型： 普遍性转导 局限性转导 (1)(1)普遍性转导（generalized transductiongeneralized transduction） 噬菌体可以转导给体

8、染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程 1) 1) 意外的发现 19511951年，Joshua LederbergJoshua Lederberg和Norton ZinderNorton Zinder为了证实大肠杆菌以外 的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型 的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验： 用“U U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞 不接触的情况下，同样出现原养型细菌！ 沙门氏菌LT22ALT22A是携带P22P22噬菌体的溶源性细菌 另一株是非溶源性细菌 一个表面看起来的常规研究却导致 一个惊奇和十分重要发现的重要例证！ 基因的传递很可能是由可透过“U U”

9、型管滤板的 P22P22噬菌体介导的 （普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现） 管的中间用烧结玻璃滤板 隔开，它只允许液体和比 细菌小的颗粒通过 管的右臂放溶源性细菌 LA-22LA-22（受体），左臂放 敏感菌LA-2LA-2（供体） 用泵交替抽吸，使两 端的液体来回流动 LA-22LA-22端出现了原养型 的个体（his+,try+his+,try+） 实验现象 溶源性菌株LA-22 LA-22 中少数细胞在培养 过程中自发释放出温和型噬菌体P22 P22 通过滤板感染另一端的敏感菌株LA-2 LA-2 LA-2LA-2裂解后，产生大量的“可滤过因子 ”，其中极少数在成熟过程中包裹了 L

10、A-2LA-2的DNADNA片段( (含try+try+基因) ) 通过滤板再度感染LA-22 LA-22 重组后得到原养型（his+,try+his+,try+）的转导子 鼠伤寒沙门氏菌的普遍性转导 转导噬菌体为什么“错 ” 将宿主的DNADNA包裹进去? ? 噬菌体的DNADNA包装酶酶也能识别染色体DNADNA上类似pacpac的位点 并进行切割，以“headfulheadful”的包装机制包装进P22P22噬菌体外壳， 形成只含宿主DNADNA的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）。 因为染色体上的pacpac与P22 DNAP22 DNA的pacpac序列不完全相同， 利用效率较低，这种“错装

11、”机率一般仅约1010-6 -6-10 -10-8 -8 形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须 具有能偶尔识别宿主DNADNA的包装机制并在宿主基因组完全降解 以前进行包装。 普遍性转导的基本要求： 普遍性转导的三种后果： 进入受体的外源DNA通过与细胞染色体 的重组交换而形成稳定的转导子 流产转导（abortive transduction） 转导DNA不能进行重组和复制，但其 携带的基因可经过转录而得到表达。 特点：在选择培养基平板上形成微小菌落 外源DNA被降解，转导失败。 DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA， 而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。

12、(2)(2)局限性转导（specialized transductionspecialized transduction） 温和噬菌体感染 整合到细菌染色体的特定位点上 宿主细胞发生溶源化 溶源菌因诱导而发生裂解时， 在前噬菌体二侧的少数宿主 基因因偶尔发生的不正常切 割而连在噬菌体DNADNA上 部分缺陷的温和噬菌体 把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中 温和噬菌体裂解时的 不正常切割：包含gal或bio基因 （几率一般仅有10-6） 缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行复制、 包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。 但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通

13、过 DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。 局限性转导与普遍性转导的主要区别： a a）被转导的基因共价地与噬菌体DNADNA连接，与噬菌体DNADNA一起 进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的 可能全部是宿主菌的基因。 b b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因 导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基 因具有随机性。 溶源转变（lysogenic conversionlysogenic conversion）： 一个与转导相似又不同的现象 温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因 整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。

14、 溶源转变与转导的不同？ a a）不携带任何供体菌的基因； b b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的； 3.1.33.1.3细菌的遗传转化（genetic transformationgenetic transformation） 定义：同源或异源的游离DNADNA分子( (质粒和染色体DNA)DNA)被自然 或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程 自然遗传转化（natural genetic natural genetic transformationtransformation） 人工转化（artificial transformationartificial trans

15、formation） 感受态细胞：具有摄取外源DNADNA能力的细胞 （competent cellcompetent cell） 自然感受态与人工感受态的不同？ 自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性， 受细菌自身的基因控制； 人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有 摄取DNADNA的能力，或人为地将DNADNA导入细胞内。 （该过程与细菌自身的遗传控制无关！） (1)自然遗传转化（简称自然转化） 1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae） 的转化现象 目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力 进行自然转化，需要二方面必要的

16、条件： 建立了感受态的受体细胞 外源游离DNADNA分子 枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型） 分泌感受态因子 与细胞表面受 体M M相互作用 诱导特异蛋白质如自溶素表达 使细胞表面的 DNADNA结合蛋白及 核酸酶裸露出来 ，使其具有与 DNADNA结合的活性 双链DNADNA与感受态细胞表面的特定位 点吸附，DNADNA的一条单链被降解，另 一条单链进入受体细胞，并与受体 细胞染色体DNADNA的同源部分配对，接 着受体染色体上相应单链片段被切 除，并被外来的单链DNADNA交换、整合 和取代，形成杂种DNADNA， 自然转化过程的特点： a a）对核酸酶敏感； c c）转

17、化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNADNA） 给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系； d d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多； 提高质粒的自然转化效率的二种方法： 1 1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高； 2 2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转 化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-重组获救 b b）不需要活的DNADNA给体细胞； 噬菌体DNADNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒 转染(transfection)(transfection)： 现在把DNADNA转移至动物细胞的过程也称转染 提纯的噬菌体D

18、NADNA以转化的（而非感染）途径进入细胞 并表达后产生完整的病毒颗粒。 特点： 接合 (conjugation)(conjugation)： 细胞与细胞的直接接触（由F F因子介导） 转导(transduction)(transduction)： 由噬菌体介导 自然遗传转化(natural genetic transformation)(natural genetic transformation)： 游离DNADNA分子 + + 感受态细胞 “接合” “转导” 及“自然转化”这三种在自然界中 存在的细菌遗传重组过程各自的特点： a）外源DNA的来源及进入途径有差异； b）决定因素也各有不同； (2)(2)人工转化 用CaClCaCl2 2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。 在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段， 是基因工程的奠基石和基础技术。 不是由细菌自身的基因所控制；