液相色谱—串联质谱法测定牛奶中粘杆菌素和多粘菌素B的残留量-文档资料

1、液相色谱串联质谱法测定牛奶中粘杆菌素和多粘 菌素 B 的残留量 Determination of Colistin and Polymycin B Residues in Milk by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spetrometry LIANG Xue-qi LIU Hong * HE Feng-qin （Zhongshan AgriculturalProducts Quality Supervision 流动相如表1所示；柱温30 C;流速为0.3 mL/min; 进样量20卩Lo 1.3.2质谱条件。电离方式：ESI+，检测模式：多反应检测 (

2、MRM，毛细管电压：4 000 V，干燥气流量10 mL/min，干燥 气温度：350 C,雾化器压力 40 psi，定性离子对、定量离子 对及碰撞能量如表2所示。 1.4 样品前处理 1.4.1提取。准确吸取5 mL牛奶于50 mL带盖离心管中， 加入5%高氯酸10 mL,摇床水平震荡30 min，超声提取10 min , 10 000 r/min 于4 C下离心8 min，把上清液转移到用另一离 心管，残渣再用5%高氯酸5 mL清洗，超声提取5 min，水平摇 床上震荡10 min , 10 000 r/min 于4 C下离心5 min，合并上 清液，加入8 mL乙醚，水平摇床上震荡 15

3、 min , 10 000 r/min 于4 C下离心8 min，吸取下清夜于试管中，以待净化。 1.4.2净化。以3 mL甲醇活化，再用3 mL纯净水平衡固相 萃取小柱，转移样品提取液至固相萃取柱，接着依次用5%甲醇 水溶液3 mL 2%丙酮水溶液3 mL, 3 mL纯净水淋洗，负压抽干， 最后用0.2%甲酸/甲醇(3 : 7 V/V) 6 mL洗脱，洗脱液用标有刻 度的玻璃试管收集，45 C下氮气吹至1 mL以下。 1.4.3上机测定。浓缩液用 2 g/L甲酸定容至1 mL,漩涡 均匀，过0.22卩m针孔滤头，转移至样品瓶，上机检测。 2 结论与讨论 2.1 色谱条件的选择 由于粘杆菌素B

4、是由A和B 2种组分构成的多肽类抗生素， 并且粘杆菌素中A和B所占比例大，因此该方法采用粘杆菌素A 和 B 的色谱峰面积加和作为定量标记物。 试验中考察了 0.1%甲酸水 - 甲醇、 0.1%甲酸水 - 乙腈 +0.1%甲 酸、2 g/L 甲酸水-乙腈+0.1%甲酸 3种流动相体系对分析效果的 影响，结果表明，采用 2 g/L 甲酸水 - 乙腈+0.1%甲酸作为流动相 时粘杆菌素和多粘菌素 B药物的离子化效率高，峰型好，灵敏度 高。 2.2 质谱条件的优化 粘杆菌素、多粘菌素B是多肽类抗生素，多肽类化合物带有 多个电荷，根据粘杆菌素和多粘菌素 B的结构特征，该试验选择 ESI正模式作为电离模式

5、。采用1.0 g/mL的单独标准液通过 两通管进入质谱中对粘杆菌素、多粘菌素B的毛细管电压、碎裂 电压、 碰撞能等参数进行优化使化合物响应值达到最高点， 其参 数如表 2 所示。 粘杆菌素和多粘菌素 B 在正离子模式下容易质子化， 全扫描 在2001 000 u质量范围内，发现6个强度较大的准分子离子 峰，分别为粘杆菌素 A的M+2H2+峰(m/z 585.6 )和M+3H3+ 峰(m/z 390.8 )(图 1),粘杆菌素 B 的M+2H2+峰(m/z 578.5 ) 和M+3H3+峰(m/z 386.1 )(图 2),多粘菌素 B 的M+2H2+ 峰(m/z 602.6 )和M+3H3+峰

6、(m/z 402.1 )(图 3)。通过对 毛细管电压、碎裂电压、碰撞能等参数优化，选择响应值相对最 大的 m/z 390.8 、m/z 386.1 和 m/z 402.1 为母离子。然后对其 母离子进行子离子扫描，最后得出粘杆菌素A 的子离子分别是 101.1和384.9 ;粘杆菌素B的子离子分别是101.1和380.2 ; 多粘菌素B的子离子分别是101.1和396.2，其中选择峰度相对 较大的 101.1 作为定量离子。 2.3 线性范围和相关系数 在该试验条件下多粘菌素 B和粘杆菌素混合标准溶液的浓 度在 25、50、100、200、400、600、800、 1 000 ng/mL 各

7、取 20 卩L进样，记录色谱图，线性方程和相关系数，如表3所示。 2.4 方法检出限、回收率和精密度 配置一系列标准工作溶液， 做基质标准曲线其线性方程、 相 关系数如表 3 所示。通过对空白样品添加标准溶液并以 3 倍信噪 比估算出(LOD S/N3)检出限如表4所示。按照1.4方法进行 LOD的加标回收试验，吸取 5mL的空白样品，分别加入 50、100、 200 ng/mL 的混合标准品，相当于加入 10、 20、 40 ug/L 的粘杆 菌素和多粘菌素B,做5次平行试验，结果如表 4所示。 3 结论与讨论 该试验建立了 LC-MS/MS法测定牛奶中粘杆菌素和多粘菌素 B残留量的分析方法。样品直接用高氯酸沉淀蛋白，乙醚去除脂 肪，通过 Strata-X 固相萃取柱净化，经氮吹浓缩后上机分析。 粘杆菌素和多粘菌素 B( LOD分别为4、7卩g/L ,定量下限(LOQ 为10卩g/L