完整版PCR技术包含引物设计

1、聚合酶链式反应（PCR）原理：DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解 链 成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则 复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因 此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子， 加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类 似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡 核昔酸引物。PCR由变性-退火（复性）-延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94 C左右一定时间后， 使模板DNA双链

2、或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单 链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链 后，温度降至4060 C左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配 对结合； 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72C左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱 基配 对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”， 而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分 钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术分类（常用）（1）反向PCR

3、技术（Inverse PCR, IPCR）:反向PCR是克隆已 知序列旁侧序列的一种方法主要原理是用一种在已知序列中无切点 的限制性内切酶消化基因组DNA.后酶切片段自身环 化以环化的 DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹 在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上 述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA,再通过反向PCR获得未知片段。(2) 锚定PCR技术(Anchored PCR,APCR):用酶法在一通用弓I物 反转录CDNA3-末端加上一段已知序列，然后以此序列为引物

4、结合 位点对该cDNA进行扩增，称为APCRo(3) 不对称PCR技术(asymmetric PCR):两种引物浓度比例 相差较 大的PCR技术称不对称PCRo在扩增循环中引入不同的引物浓度， 常用50-100- 1比例。在最初的1015个循环中主要产物还是 双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后，高浓度引物介导的PCR反 应就会产生大量单链DNAo(4) 反转录 PCR 技术(reverse transcription PCR, RT-PCR):当 扩 增模板为RNA时，需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行 扩增。应用非常广泛，无论是分子生物学还是临床检验等都经常采 用。(5) 巢式P

5、CR技术(NEST-PCR):先用一对靶序列的外引物扩 增以提高模板量，然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带，此为巢式PCRo若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCRo 为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些，且用 量较少，同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较 低的退火温度，这样在第一次PCR时，由于较高退火温度下内引物 不能与模板结合，故只有外引物扩增产物，经过若干次循环，待外 接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤，同时也降低了交叉污染的引物基本消耗尽，无需取出第一次PCR产物,只需降低退火即可直机会。这种PCR称中途进退式PCR,主要用于极少量DNA

6、模板的扩增。(6) 多重PCR技术(multiplex PCR):在同一反应中用多组引物 同时 扩增几种基因片段，如果基因的某一区段有缺失，则相应的电泳谱 上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同时 检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。(7) 重组PCR技术：重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中： 两对引物分别由其中之一在其5-端和3-端引物上带上一段 互补的 序列，混合两种PCR扩增产物，经变性和复性，两组PCR产物互 补序列发生粘连，其中一条重组杂合链能在PCR条件下发生聚合延伸反应，产生一个包含两个不同基因的杂合基因。(8) 原位PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小的反

7、应体 系来 扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特 定的 检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石 蜡包埋组 织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位，适用于检 测病理切片中含量较少的靶序列。(9) 荧光定量实时PCR技术反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升，最 终 DNA扩增量可用丫=(1+X)n计算，丫代表DNA片段扩增后的拷贝 数，X表示平均每次的扩增效率，n表示循环次数。平均扩增效率理 论值为100%,但实际情况达不到，反应初期靶序列DNA片段的增 加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩 增的DNA片段不 再呈指数增

8、加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效 应”，此效应称平台期，与DNA聚合酶数量和活性、PCR扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分，短产物片段的长度严格 地限定在两个引物链5 端之间，是需要扩增的特定片段。短、长产 物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一个原始模板为 例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3, 端开始延伸，其5,端是固定的，3,端则没有固定的止点，长短不 这就是长产物片段。进入 第二个反应周期后，引物除与原始模 板结合外，还要同新合成 的链(长产物片段)结合引物在与新链结合 时，由于新链模板

9、的5,端序列是固定的，故这次延伸的片段3端 被固定了止 点，保证了新片段的起点、止点都限定于引物扩增的序列以内，形 成长短一致的短产物片段。由于短产物片段是按指数倍数增加，而 长产物片段则以算术倍数增加，故可忽略不计，使 得PCR的反应产 物不需再纯化既可以保证足够纯的DNA片段供分析、监测。反应五要素引物、模板、DNA聚合酶、四种dNTPv Mg2+(1 )引物设计 引物长度：15-30bp,常用为20bp左右。 引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb 的片段。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC

10、最好随机分布，引物自身 连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基 的互补性。【引物的GC含量和Tm值应该协调：Tm=4 ( G+C) +2 ( A+T)】 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3,端 的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3，端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任 何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般 3 端也不能发生 错配，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。5,端无严格限制，只起限定PCR产物长度的作用，对 扩增 特异性影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物o 引物中有或能加上合适的酶切位

11、点，被扩增的靶序列最好有 适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源 性。 引物量：每条引物的浓度0.11umol或10100pmol,以 最低 引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。(2) DNA聚合酶：目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从 栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程 酶。催化一典型的PCR反应约需酶量0.5-2.5 U/50 ml ,浓 度过高可 引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。(3) dNTP的质量与浓度：dNTP

12、溶液呈酸性，使用时应配成 高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的缓冲液将其PH调节至IJ 7.07.5,小量分装，-20C冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50-200umol/L,尤其是注意4种 dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于 其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低 又会降低 PCR产物的产量。（4）模板（靶基因）核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA纯化方法通常采用SDS和 蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂 类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏

13、细胞膜，并解离细胞中的核蛋 白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与 氯仿 抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核 酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR反应。（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时， Mg2+浓度为1.520mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反 应特异性降 低出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。RT-PCR -是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩 增 （PCR相

14、结合的技术。总RNA提取（-70 C保存）Trizol 法：1、取组织100哑于玻璃匀浆器中，加入1ml Trizol冰上抽打匀 浆 （边匀浆边暂停）2、移入1.5mlEP管中，颠倒混匀，室温保存5min3、加氯仿0.2ml （总体积的1/5 ）,振荡混合，室温放置5min4、4 C,离心 12000 rpm , 15min5、取上层液相（约400卩I）移入一新1.5ml EP管中，加等体积异 丙醇（约400卩I）,振荡混合，室温保存10min6、4 C,离心 12000 rpm , 10min7、弃上清液，力Q 1ml 75%无水乙醇（4C保存）,振荡混合& 4 C,离心 7500 rpm

15、, 5min 9、弃上清液，室温放置20min （EP管倒置在滤纸上）使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）10、力口 20ul DEPC水至EP管中，在60 C孵育3-5min （或手握3-5min）,使RNA充分溶解（可保存在液氮或低温冰箱-70 C）测RNA浓度：走RNA变性电泳观察18s、28s条带，分光光度 计检 测260/280吸光度比值 调零:750ul DEPC 水测量：745ul DEPC 水 + 5ul RNA总RNA浓度=OD260X40X稀释倍数（150倍）ug/ml=OD260 40Xl5Xug/ml=OD2606 ug/ul XA1/A2应在1.8-2.0之间注意：提取R

16、NA的质量主要是要通过260/280的比值看是不是在2.0左右，当OD260/OD280V1.8时提示有蛋白或酚的污 染，需要 进一步纯化RNA;还要跑胶看看28s、18s、5s的三条 带是不是清晰，一般质量好的RNA, 28s:18s的亮度比例在2:1左右，最后一条5s的应该比较淡。逆转录RT （cDNA: 一周内-20 C保存，长期70 C保存）RT反应体系：20ul体系第一步：约20分钟RNA抽提物Radome引物2卩IRNAsin0.5 口 11 v 65 C 15 分钟2、立即放入冰浴第二步：约2小时RNAsi n 10mM 0.5 dNTP5X RT 缓 冲液 25mM MgCI2

17、AMV 1 v 37C 1.5 小时2、94 C 5-10 分钟3、反应物保存于-20 C或进行PCR聚合酶链反应PCR （产物-20 C保存）PCR反应体系:100 al体系约4.5小时约5小时25mM MgCI22al3a10 X PCR缓冲液5al5al10mMdNTP1a I1a10pmol/ a 1上游引物2.5 a I2.5 a I10pmol/ a 1下游引物2.5 a I2.5 a IcDNA模板2.5 a I5alddH2O34a I 30Taq酶0.5卩丨1卩I轻质石蜡油50卩I 50卩I1、94 C 2分钟，55 C 1分钟，72 C 2分钟为第一个步1个循环2、94C4

18、5秒，55 C 40秒，72 C 1分钟为第二步30/40个循环3、72C 10 分钟4、取出后4 C保存，5分钟后-20 C保存或走电泳 琼脂糖凝胶电泳：约1.25小时1、配制0.5 X TBE电泳缓冲液300 ml2、配制凝胶浓度1.7% （40ml 0.5 X TBE加0.68g胶），微波炉中 火2分钟溶解胶，冷却至60 C加入漠乙锭2!卩I （10mg/ml的终浓 度0.5卩g/ml ）,充分混匀3、将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30 45min后现进行电泳4、加样8卩I PCR反应产物+2卩I漠酚兰，空一格加DNA marker5、电泳50-80V 5电场强度不宜高

19、于5V/cm6、在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成 像系统拍照保存。电泳缓冲液（5X TBE贮存液）：Tris54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA 20ml pH80、加蒸溜水至1000ml o使用时，将5X TBE稀 释10倍成0.5XTBE就可以在电泳时使用（工作浓度）。上样缓冲液（6 X缓冲液，4 C保存）：0.25%漠酚蓝、0.25%二甲 苯青FF、30%甘油琼脂糖凝胶配制：（1.0% ）1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾（如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志），熔化的琼脂物冷却至60 C时加入10mg/ml漠化乙锭5卩I,充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在 室温下放置30-45min （可以放入4度冰箱加快琼脂糖凝固