MicroRNA研究概况以及MicroRNA芯片技术简述MicroRNA的研究

1、MicroRNA 研究概况以及 MicroRNA 芯片技术简述 一、 MicroRNA 的研究概况 1. MicroRNA MicroRNA（miRNA , miR）是由约21-25个核苷酸组成的分子， microRNA 通过抑制 mRNA 的翻译或者促进其降解而起到负性调控的作用。最初 miRNA 的功能在植物学、癌症、病毒性感染和发育生物学中得到了验证。但最近的研 究发现，患有心脏疾病的小鼠对照正常状态 miRNAs 失调，并且在肥大的心脏 中也检测到了数种 miRNA 的上调或者下调， 同时体外实验也证实了它们对心肌 细胞形态的影响。 2. MicroRNA 的研究进展 miRNA现象的

2、最早报道是在 佃80年的Genetics和Cell上。佃93年在线虫中发现的lin-4 是第一个被确定的 miRNA 31，它的基因产物是 21 个核苷酸的 RNA 分子并且部分序列互 补于lin-14 mRNA的3 UTR区域。这些互补序列使lin-4间断地与lin-14 mRNA结 合。奇怪的是，lin-4没有明显地改变lin-14 mRNA的量，但是Lin-14蛋白表达 却明显降低。2000年又在线虫中发现了与 lin-4相似的miRNA let-7，它们参与线虫 发育的时空调节。 miRNA基因首先被RNA聚合酶H转录为较长的初始转录本，该转录本含有数 千个核苷酸，称其为 pri-mi

3、RNA。在pri-miRNA内，miRNA位于由大约70个核苷酸 构成的环柄结构内。在动物体内，该环柄结构在细胞核内被RNA酶川Drosha和其辅助 蛋白 Pasha/DGCR8 识别和切割，形成 pre-miRNA 。之后， pre-miRNA 迅速被核质 /细胞质转运蛋白Exportin5转运至细胞质，被位于细胞质内的 RNA酶川Dicer 进一步切割。产生一个类似于 siRNA 的 miRNA ：miRNA* 复合体，随后，该双链体 解旋为成熟的 miRNA和miRNA*，成熟的miRNA在一种 ATP-依赖的沉默复合体 （RISC ） 中，形成非对称的 RISC 复合物。而 miRNA

4、* 则可能类似于 siRNA 被 Argonaute 蛋白处理 掉。成熟miRNA通过与特定靶基因 mRNA的3 UTR完全或不完全的碱基互补方式 引导 RISC 与目的 mRNA 结合，从而降解靶 mRNA 或抑制靶 mRNA 的翻译（见图 1），其 中以抑制翻译为主。 另外最近发现 miRNA 与靶 mRNA 结合后， 可使靶 mRNA 被外切酶降 解。 miRhjA ww- Cytaplswi Nucleus PtBHTiiRN 串 EjpwlinJ. (OQnnc (rnRW-fnHJMA-) Tianhboiral repression nhRNA dsiMsga tOttht 图1

5、 miRNA的形成和功能模式图 miRNA是一类进化上保守、在生命中起着重要调控作用的分子。多种 miRNA在同一个细胞中的表达使得细胞处在一种内在的miRNA环境中，这个 环境控制着成千上万的编码基因的 mRNA水平，使得各种蛋白的表达处在一个 适合的水平。miRNA的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在 RNA水平对靶mRNA分子进行更迅速和有效的调节， miRNA的发现也是对中 心法则中RNA次要的中介角色的重要补充。 miRNA在基因组中的数量（预计 在人类基因中含量1%，参与至少10%基因的表达调控）和表达水平（一些 miRNAs在每个细胞中的拷贝数1000），说明miRN

6、A是一种含量丰富的 RNA 种类。而且每个miRNA具有调节数百个mRNA的潜能；因此在各类小分子RNA 中，miRNA具有最广泛的基因调节功能，它能对基因活动的各个层面进行调节。 miRNA的靶基因一般为动植物中发育基因，表明 miRNA在控制生物发育方面 有不容忽视的作用。miRNA可参与生命过程中的一系列重要进程，包括早期胚 胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢等方面。 随着近年来研究的不断深入，人们开始认识到小RNA分子在真核基因表达 调控中有着广泛的作用。目前研究发现miRNA发挥功能的领域有：生物个体发育； 组织分化；病毒感染；参与癌基因作用。 随着对miRNA研究的不断

7、增加，已经有大量的 miRNA为科研工作者们发现。 近年来, 更是随着生物信息学的不断进步，通过预测发现了更多的miRNA，但是这些预测的结果还 必须要通过实验的验证才能为事实所接受。 目前 miRNA 的研究领域主要包括 miRNA 表达谱和 miRNA 功能分析。由于 miRNA 在众多程序的调控，诸如生物发育、细胞增殖、凋亡以及与肿瘤发生相关等领域发 挥作用， miRNA 的鉴定和定性研究成为迅速发展的一大研究领域。最典型的鉴定 miRNAs 的方法是检测 miRNA 的表达谱， 如果发现某一种 miRNA 在某种特定组织或细胞中特异性 表达的话， 此 miRNA 将被假定在此特定组织或

8、细胞中发挥某种调控作用。同样， 如果某一 种 miRNA 在生物特殊发育阶段表达的话，则它有可能是调控发育进程一个主要分子。 miRNA 的表达谱可以通过克隆特定组织、细胞或者某个生物体特定发育阶段的 miRNA 并 测序完成， 或者通过芯片检测得以完成。 克隆和测序 miRNA 是目前最常用的一种方法， 虽 然相当费时费力，但却可以发现新的miRNA ；而芯片检测虽然是一种高通量的检测方法， 但只能检测已知的 miRNAs 表达水平。 随着成百上千的 miRNA 被鉴定出来，通过抑制细胞中 mRNA 的表达水平来研究 miRNA 的功能迅速发展为一个重要的研究领域。在此期间， miRNA 在

9、生理状态下的靶标 须待鉴定， 因此在探索 miRNA 功能的过程中运用人工合成的 miRNA 抑制剂成为一种重要 的研究工具。 miRNA 的活性可以通过对与内源性 miRNA 互补的磷酰二胺吗啉代反义寡核 苷酸( morpholino phosphorodiamidate anti-sense oligonucleotides )的化学修饰阻断。另 外，反义阻断的核苷酸( locked-nucleic acid, LNA )具有更高的结合亲和力，通常被用来抑 制人体细胞的 miRNA 。 LNA 修饰的探针也用来检测 miRNAs 的定位和表达方式。 二、 MicroRNA 芯片技术简述 1

10、. 样品 RNA 抽提 a. 实验对象为组织样品，取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的 组织样品，冰冻粉碎组织，加1ml的RNA抽提试剂Trizol,匀浆后抽提RNA。 b. 实验对象为细胞样品，每份样品取 1X1071X108细胞，加1ml的RNA 抽提试剂Trizol，样品为贴壁细胞，每10cm2培养皿Trizol使用量为1ml，裂解 后抽提 RNA。 2. RNA 质量检测 a.测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓 度并评估纯度。 b. 用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测 RNA 纯度及完整性。 c.提供RNA QC报告。 注意：用于芯片检测的RNA样品，必须是高质量的，完整的，没有 RNase 污染（降解的样品不能用于标记和芯片检测），没有基因组污染。 3. 制备荧光标记探针 荧光基团标记miRNA