流式细胞术在肿瘤学中的应用

1、 在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征 的一种仪器 Injector Tip Sheath fluid 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参 数分析； 可检测的样本种类多样 (1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组 织，培养细胞 (2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 细胞周期及DNA倍体分析在临床肿瘤中应用 免疫指标检测在临床肿瘤中应用 监测分析肿瘤多药耐药 细胞凋亡 通过DNA检测进行细胞周期分析 细胞周期：G0、G1、S、G2 、M 细胞周期中DNA含量：G0/G1-2C（二倍体） S期-2C 4C、G2/M-4C（四倍体） DNA荧光染料特异性与细胞DNA结合 DNA含量的

2、多少与荧光染料的结合量成正比， 荧光强度与DNA所吸收荧光分子多少成正比。 最常用的荧光染料：碘化丙啶（PI） 细胞群的DNA含量在FCM中一般以DNA指数 （DNA index，DI)表示相对含量，一个正常 的二倍体细胞峰，其G0/G1期细胞DNA含量为 2C，DI值为1.0。 DI=（样本G0/G1期细胞峰平均荧光道数）/ （正常二倍体标准细胞G0/G1期细胞峰平均荧 光道数） 二倍体的DI为1.0，四倍体的DI为2.0。 变异系数（CV）：标准细胞CV 3%，新鲜组 织标本5%。 DNA倍体判定标准，DNA非整倍体具有2个分 离的G0/G1峰，并根据DI值判断DNA倍体。 对于一个正常人

3、体的二倍体细胞 群，G0/G1期占85-90%以上， S+G2M细胞占10-15%以下。 以二倍体参考细胞G0/G1期细胞DNA含 量定为2C值DI=1.0，基于标准二倍体细 胞的CV在5%以下，判定标准即；DNA 二倍体=2C+2CV，DNA异倍体不等于 2C+2CV。 1. DI = 1.0 0.1 (0.91.10) 为二倍体。 2. DI = 1.0 0.15 (0.851.15) 为近二倍体。 3. DI = 2.0 0.1 (1.902.10) 为四倍体。 4. DI 2.10为多倍体 5. 其余DI均为异倍体。 （一）单细胞悬液制备 1、新鲜或冰冻实体组织：酶消化法、机械法、 化

4、学试剂处理法等。 剪碎法：取新鲜或冰冻（浸泡于生理盐水中） 实体组织0.5cm3，眼科手术剪剪碎，加入生理 盐水，300目尼龙膜过滤，200g离心5min， 生理盐水洗涤二次。 半自动机械法单细胞制备系统：是目前较为理 想的方法，简便，实用，单细胞获取率较高， 特别适用于临床应用。 由于各种实体组织成份、特性各不相同，对不 同的实体组织必须采用不同的单细胞分散方法， 才能使单细胞产量高，细胞损伤小。 新鲜组织单细胞悬液制备注意事项： 手术或活检的新鲜组织及时浸泡于生 理盐水。 立即送检 冷冻或冷藏。（室温过高，放置时间 过长而造成组织自溶发生，影响检测结果） 2、石蜡包埋组织：扩大了FCM分析

5、应用范围， 并可以对大量临床随访病例资料进行重新研究与 利用。标体制备：二甲苯脱蜡法组织清洁剂 脱蜡法甲酸双氧水处理法。 注意事项：脱蜡完全：检验方法 加入100%乙 醇，如果无絮状物浮起，即可视为脱净，反之则 没有脱净。掌握消化时间，避免细胞核消化掉。 切片薄厚适宜，过薄碎片大多，过厚不宜脱蜡。 3、骨髓、血液及体液：去除红细胞及浓缩有 核细胞。骨髓及血液：淋巴细胞分离液体 液：一般需经300g离心5min，PBS洗涤二次。 如体液中红细胞太多，可用溶血素去除红细胞。 注意事项：每次同时制备对照血液淋巴细胞 标本，作为二倍体细胞外参标准。视标本中 有核细胞浓度的高低进行调整，一般细胞浓度 调至510*109/L。 1、PI染色法 应用BD公司Cycle TEST IMK Kit （1）单细胞悬液制备 （2）加入A液250ul，放置10分钟。 （3）加入B液200ul，放置10分钟。 （4）加入冷C液200ul，避光放入2-8C冰箱 10分钟。置28C冰箱避光保存，4h内FCM检 测 （5）流式细胞分析：流式细胞仪校准与设置、 数据获取用Cellquest软件，SSC/FSC、FL2 设置为线性放大，阈值设为FL2。 收集图：FSC/SSC和FL2W/FL2A散点图、 FL2-H或FL2-A荧光直方图 数据分析：ModFit软件 流式细胞周期与DNA倍体分