十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳法(CE-SDS法)标准操作规程SOP（参考）

1、十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳法 CE-SDS 法 标准操作规程类别工作标准文件文件编号XXXXX版本号V01页码共页执行日期年 月 日 制止复印审批页起草人审核人审核人批准人部门分析研究部分析研究部分析研究部质量保证部姓名签名日期年月日年月日年月日年月日颁发部门：质量保证部 分发部门：分析研究部 拷贝号： NO. /文件变更历史版本号执行日期变更原因、根据及变更内容V002019年 03月 10日新起草目录1 目的 42 范围 43 定义 44 环境、安康和平安 45 培训 46 职责 47 程序内容 47.1 原理 47.2 实验材料 47.3 操作步骤 57.4 结果分析 97.5 断定标

2、准 97.6 考前须知 98 相关文件 109 参考文献 1010 流程图 1011附 录 10十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳法 CE-SDS 法测定记录 1十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳法 CE-SDS 法测定记录 适用于多个样品 11 目的标准十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳法 CE-SDS 法检验的操作过程。2 范围 本规程适用于常规十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳检验，涉及到蛋白质纯度 相关指标的测定。3 定义3.1 CE-SDS：十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳。4 环境、安康和平安 复原电泳中使用的巯基乙醇为挥发性液体，具有较强烈的刺激性气味，会刺 激眼睛、呼吸系统和皮肤，吞食有害，与皮肤接触有毒

3、，取液时穿戴适当的防护 服、手套和护目镜或面具。如不慎与眼睛接触后，请立即用大量清水冲洗并征求 医生意见。该液体对水体环境能产生长期污染等不良影响，切勿倒入下水道，应 倒入废液桶，由专业部门回收。与空气混合、受热、明火可爆，如其燃烧可用二 氧化碳、干粉类灭火剂。储存库房应通风低温枯燥，与氧化剂、食品分开储运。5 培训5.1 培训部门：分析研究部。5.2 培训对象：分析研究部相关人员。5.3 培训方式和时数：自学， 0.5 小时。5.4 考核方式：问答。6 职责6.1 质量保证部：负责监视本文件的执行。6.2 分析研究部：负责严格执行本规程规定。7 程序内容7.1 原理该方法是指以弹性石英毛细管

4、为别离管道，以高压直流电场为驱动力，通过 目的蛋白在含有胶的溶液中的迁移速率不同而得到别离，较小分子量的分子迁移 速度更快那么其迁移时间短，较大分子的迁移速度慢那么其迁移时间更长。该方法主 要能检测分子量在 10kDa 以上的降解片段。7.2 实验材料7.2.1 试药与试液超纯水：电阻率不低于 18.2M c，m本方法所有试液均用超纯水配制。 ：Beckman消费，货号 390953，该试剂盒中包含 SDS- MW 凝胶别离缓冲液、 SDS-MW 样品缓冲液样品稀释液、酸性清洗液0.1mol/L 盐酸溶液、碱性清洗液 0.1mol/L 氢氧化钠溶液 、内标物质 10kDa Internal S

5、tandard。也可采用北京博思雅生化技术研究院消费的 SDS试剂盒，货号 BSYK018， 该试剂盒中包含 CE-SDS Gel Buffer 、CE-SDS Sample Buffer样品稀释液 。也可 采用同类型其它品牌的商品化试剂盒。烷基化溶液 0.25mol/L 碘乙酰胺溶液：称取约 0.046g碘乙酰胺，参加 1ml 超纯水溶解混匀，可于 28避光保存 7 天。巯基乙醇。系统适用性样品： 如无特殊规定， 应采用经特殊处理后的系统适用性专用样 品处理方法见各工程下规定 ；也可选用相应原研药或各工程自制工作对照品。7.2.2 仪器与用具毛细管电泳仪： AB SCIEX 公司 PA 80

6、0plus或 CESI 8000 Plus。 毛细管卡盒：适用于 中毛细管电泳仪的毛细管卡盒。7.2.2.3 毛细管：非涂层 -熔融石英毛细管内径 50m，切割至总长为 30.2cm，高 分辨率方法有效别离长度为 20cm，高效方法有效长度为 10cm。7.2.2.4 孔塞：孔塞大小 8100m800m。其他：CE 通用样品瓶、蓝色橡胶通用样品瓶瓶盖、 200l微量管内插管、 移液器、水浴锅或金属浴 、台式离心机、离心管、超滤管。7.3 操作步骤7.3.1 供试品制备供试品稀释1空白对照： 取当次检测供试品对应的缓冲液 如原液缓冲液或制剂缓冲液 ， 分别用稀释液SDS样品缓冲液进展稀释稀释倍数

7、同供试品，作为空白对照。2系统适用性：取各工程下规定的系统适用性样品，用稀释液 SDS-MW 样品 缓冲液稀释至终浓度约为 1.0mg/ml。3原液：根据待测原液浓度，用稀释液 SDS-MW 样品缓冲液稀释至终浓度 约为 1.0mg/ml。4成品：假设为液体制剂，根据标示含量，直接用稀释液 SDS-MW 样品缓冲液 稀释至终浓度约为 1.0mg/ml；假设为冻干制剂，那么先用水复溶后， 根据复溶后理论含 量，再用稀释液 SDS-MW 样品缓冲液稀释至终浓度约为 1.0mg/ml 。 非复原供试品溶液制备： 取稀释后供试品溶液各 95，l各参加 10kDa Internal Standard 2

8、 ，再l各参加 0.25mol/L 碘乙酰胺溶液 5，l涡旋混匀。7.3.1.3 复原供试品溶液制备：取稀释后供试品溶液各 95，l各参加 10kDa Internal Standard 2 ，再l各参加 2-巯基乙醇 5，l涡旋混匀。7.3.1.4 将各供试品溶液在 70孵育，非复原供试品溶液孵育 5 分钟，复原供试品 溶液孵育 510分钟。冷却至室温后以每分钟 6000转离心 1 分钟。从样品管中分 别取出样品至 200l微量管中，将 200l微量管放入 CE 通用样品瓶中，盖好蓝色 橡胶通用样品瓶瓶盖，放置样品盘中待检测分析。7.3.2 缓冲液瓶的准备和摆放 按下列图和下表参加各入口缓冲

9、液，并用蓝色橡胶通用样品瓶瓶盖盖好。图 7.1 入口缓冲液摆放图示表 7.1 入口缓冲液参加体积及用处CE 通用瓶位置入口缓冲液参加体积入口缓冲液用处A1 至 A6超纯水 1.5ml冲洗毛细管B4 至 B6超纯水 1.5ml冲洗毛细管B1 至 B3SDS 凝胶别离缓冲液 1.2ml冲洗毛细管C1至 C3SDS 凝胶别离缓冲液 1.1ml供试品别离D1 至 D3碱性清洗液 0.1mol/L 氢氧化 钠溶液 1.5ml每针之前冲洗毛细管E1至 E3酸性清洗液 0.1mol/L 盐酸溶 液 1.5ml每针之前冲洗毛细管F1至 F3超纯水 1.5ml每针之前冲洗毛细管按下列图和下表参加各出口缓冲液，并

10、用蓝色橡胶通用样品瓶瓶盖盖好图 7.2 出口缓冲液摆放图示表 7.2 出口缓冲液参加体积及用处CE 通用瓶位置出口缓冲液参加体积出口缓冲液用处A1 至 A6超纯水 1.5ml冲洗毛细管B1 至 B3超纯水 0.8ml冲洗 SDS 凝胶别离缓冲 液的废液瓶B4 至 B6超纯水 1.5ml冲洗毛细管C1至 C3SDS 凝胶别离缓冲液 1.1ml供试品别离D1 至 D3超纯水 0.8ml冲洗碱性清洗液的废液瓶E1至 E3超纯水 0.8ml冲洗酸性清洗液的废液瓶F1 至 F3超纯水 0.8ml冲洗超纯水的废液瓶7.3.3 编辑方法并调用方法表 7.3 电泳操作参数高分辨率别离法别离参数参数设置检测器波

11、长214nm 或 220nm，带宽 10nm毛细管温度20样品温度102分析方法步骤事件总结1碱性溶液冲洗0.1mol/L 氢氧化钠， 70psi下 3 分钟，向前2酸性性溶液冲洗0.1mol/L 盐酸， 70psi下 1 分钟，向前3水冲洗70psi下 1 分钟，向前4SDS凝胶冲洗 /灌装SDS凝胶灌装， 70psi下 10分钟，向前5凝胶后浸润 1水浸润 0.0 分钟6凝胶后浸润 2水浸润 0.0 分钟7样品注射5 kv 下 20 秒，反相极性8注射后浸润水浸润 0.0 分钟9电压别离15 kv 下 40 分钟，温度为 20， Ramp=1.00 分钟，反相极性10自动归零5 分钟表 7

12、.4 电泳操作参数高效别离法别离参数参数设置检测器波长214nm 或 220nm，带宽 10nm毛细管温度20样品温度102分析方法步骤事件总结1碱性溶液冲洗0.1mol/L 氢氧化钠， 70psi下 3 分钟，反向2酸性性溶液冲洗0.1mol/L 盐酸， 70psi下 1 分钟，反向3水冲洗70psi下 1 分钟，反向4SDS凝胶冲洗 /灌装SDS凝胶灌装， 70psi下 10分钟，反向5凝胶后浸润 1水浸润 0.0 分钟6凝胶后浸润 2水浸润 0.0 分钟7样品注射5 kv 下 20 秒，正常极性8注射后浸润水浸润 0.0 分钟9电压别离15 kv 下 30 分钟，温度为 20， Ramp

13、=1.00 分钟，正常极性10自动归零2 分钟7.3.4 供试品检测：将供试品位置号编辑入序列表中，输入相应供试品名称与文 件名称，并调用相关方法。序列表中样品排列顺序依次为毛细管活化、空白对 照、系统适用性 1、供试品、系统适用性 2、关机，各进样检测一次其中系统 适用性 1、系统适用性 2 为同一管样品；假设稀释后供试品溶液终浓度小于 1.0mg/ml，那么可适当增加序列表中样品注射时间以增加进样量。运行序列开场检 测分析。7.4 结果分析7.4.1 复原条件：按面积归一化法计算，以重链、非糖基化重链和轻链的校正峰 面积分别占所有校正峰面积之和的百分比分别计算重链、非糖基化重链和轻链的 纯

14、度，三者之和即为产品纯度。 注：根据样品功能决定总纯度是否包含非糖基 化重链。7.4.2 非复原条件：按面积归一化法计算，以供试品主峰的校正峰面积占所有校 正峰面积之和的百分比计算单体的纯度。7.5 断定标准7.5.1 空白对照断定标准：与系统适用性图谱进展比拟，在供试品降解片段、单 体、聚合体的迁移时间范围内，空白对照应无明显的干扰峰出现。7.5.2 系统适用性断定标准7.5.2.1 非复原型电泳或复原后呈现单一主带的复原型电泳：系统适用性1 与系统适用性 2 图谱中主峰迁移时间的极差应 2.0min；主峰校正峰面积百分比极差应 0.6%。7.5.2.2 复原后呈现轻链、重链的复原型电泳：系

15、统适用性 1 与系统适用性 2 图谱 中重链迁移时间的极差应 2.0min；轻链校正峰面积百分比极差应 0.6%；重链校 正峰面积百分比极差应 0.6%。7.5.2.3 假设空白对照与系统适用性同时满足要求， 那么本次实验结果有效， 否那么实验结 果无效，供试品需复检。7.6 考前须知7.6.1 为保证供试品能与 SDS 样品缓冲液中的 SDS充分结合，供试品的稀释倍 数应2 倍。7.6.2 缓冲液瓶的数量取决于样品的个数，保证每 810 个循环都能使用新的缓 冲液。7.6.3 假设供试品溶液的缓冲体系会干扰实验结果如纯化中间样品 ，可用截距 为 10kD 的超滤管置换缓冲体系后，再进展样品检

16、测。假如供试品初始浓度较 低，可用截距为 10kD 的超滤管进展超滤浓缩，使终浓度接近 2.0mg/ml。7.6.4 根据进样口离检查窗口的间隔 ，别离方法分为高分辨率方法和高效别离方 法。在高分辨率方法中，将样品放置在左侧样品托盘中，入口缓冲液放置在左侧 缓冲液托盘，出口缓冲液放置在右侧缓冲液托盘；在高效别离方法中，将样品放 置在右侧样品托盘中，入口缓冲液和出口缓冲液互换位置。7.6.5 根据分子量大小选择高分辨率方法和高效别离方法，建议分子量约为3070kD的供试品选择高分辨率方法，分子量大于 70kD 的供试品选择高效方 法。详细选用何种别离方法见各工程下规定。7.6.6 方法中各参数，

17、如复原、非复原处理时孵育温度、孵育时间等，可根据各 工程在该方法下的验证结果进展调整。8 相关文件9 参考文献9.1 BECKMAN COULTER. PA 800plus Pharmaceutical Analysis System: SDS-MWAnalysis M. B25803AA, January 20219.2 BECKMAN COULTER. PA 800plus Pharmaceutical Analysis System: IgG Purity/Heterogeneity Assay M. B25801AA, January 20219.3 ?中国药典? 2021 年版，通那

18、么 3127 “单抗分子大小变异体测定法 CE-SDS 法10 流程图11 附录十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳法 CE-SDS 法测定记录品名批号/编号规格开检日期年月日检验根据一、实验材料1、试药与试液名称编号/批号来源系统适用性样品 SDS凝胶别离缓冲液稀释液 SDS样品缓冲液碱性清洗液 0.1mol/L 氢氧化钠溶液酸性清洗液 0.1mol/L 盐酸溶液Internal Standard kD2-巯基乙醇碘乙酰胺溶液 0.25mol/L 复溶溶剂灭菌注射用水原液缓冲液成品缓冲液2、仪器与用具名称消费厂家 /型号设备编号毛细管电泳仪 AB SCIEX / PA 800plus AB SCIE

19、X / CESI 8000 Plus水浴锅 上海精宏实验设备 /DKB-501S 其它第 1 页/共 5 页台式高速冷 冻离心机 Eppendorf/Centrifuge 5418R 其它金属浴 Thermo/Digital Cooling Drybath 其它UncoatedAB SCIEX 内径 m，有效别离长度：cm，毛细管批Capillary号： ，毛细管编号：二、操作步骤1、待测样品稀释 空白对照：取缓冲液 ，l参加稀释液 ，l混匀，稀释倍数为 倍。 系统适用性：样品初始浓度为mg/ml，取对照品，l参加稀释液 ，l混匀，稀释倍数为 倍，稀释后终浓度为 mg/ml。 原液：原液蛋白质

20、初始浓度为mg/ml，取待测原液 ，l参加稀释液 ，l混匀，稀释倍数为 倍，稀释后终浓度为 mg/ml。 成品液体制剂：成品标示量为 ，取待测成品 ，l参加 稀释液 ，l混匀，稀释倍数为 倍，稀释后终浓度为 mg/ml。 成品冻干制剂：成品标示量为 ，取成品用 ml/瓶的注射用水 复溶。取复溶后成品 ，l参加稀释液 ，l混匀，稀释倍数为 倍，稀释后终浓度为 mg/ml 。其它：2、供试品溶液制备非复原供试品溶液制备：分别取稀释后样品溶液各 ，l参加 10kDa Internal Standard ，l再参加 0.25mmol/L 碘乙酰胺水溶液 ，l涡旋混匀 后在 孵育 分钟。复原供试品溶液制

21、备：分别取稀释后样品溶液各 ，l参加 10kDa Internal Standard，l再参加 2-巯基乙醇，l涡旋混匀后供试品溶液在 孵育 分钟。3、将制备好的供试品溶液冷却至室温后以每分钟6000 转离心 1 分钟。从样品管中分别取出样品至 200l微量管中，将 200l微量管放入 CE通用样品瓶中，盖好蓝色橡胶通用样品瓶瓶盖，放置样品盘中待分析4、缓冲液瓶的准备：SDS凝胶别离缓冲液分别加 1.2mlB列与 1.1mlC列，超纯水、酸性清洗液及碱性清洗液分别加 1.5ml，废液瓶中加超纯水 0.8ml。按 照下列图位置放入相应的缓冲液瓶。别离方法：高分辨率方法 高效方法入口缓冲液，放置于

22、 侧缓冲液托盘入口缓冲液摆放见下列图出口缓冲液，放置于 侧缓冲液托盘出口缓冲液排放见下列图5、在计算机中翻开软件 32Karat，建立新的序列程序，输入对应的供试品名称与 位置，并选择相应的别离方法对供试品进展分析测定。供试品别离方法关键 参数见下表。电泳参数设定值样品进样5kV 电动进样 秒样品别离15kV 下运行 分钟检测器波长 PDA检测器 nm UV 检测器nm6、序列运行完成后，点击“ File选择“ Data与“ Method选择对应的数据与 方法；点击“ Integration Events添加积分参数； 点击“Analyze对数据进展积 分，保存积分参数和处理结果。三、结果计算

23、1、空白对照图谱中，在迁移时间min 范围内，按下表进展断定。空白对照判断标准空白对照结果断定应无明显干扰峰出现 符合要求 不符合要求2、系统适用性结果 非复原型电泳或复原后呈现单一主带的复原型电泳样品系统适用性 1系统适用性 2主峰迁移时间 min 主峰校正峰面积百分比判断标准系统适用性 1 与系统适用性 2 图谱中主峰迁 移时间的极差应 2.0min；主峰校正峰面积 百分比极差应 0.6%检测结果 主峰迁移时间的极差为 min 主峰校正峰面积百分比极差为检测标准品结果断定 符合要求 不符合要求 复原后呈现轻链、重链的复原型电泳样品系统适用性 1系统适用性 2重链迁移时间 min 轻链校正峰

24、面积百分比重链校正峰面积百分比判断标准系统适用性 1 与系统适用性 2图谱中重链迁 移时间的极差应 2.0min；轻链校正峰面积 百分比极差应 0.6%；重链校正峰面积百分 比极差均应 0.6%检测结果 重链迁移时间的极差为 min 轻链校正峰面积百分比极差为 重链校正峰面积百分比极差为检测标准品结果断定 符合要求 不符合要求3、本次实验，空白对照和系统适用性均符合要求 未全部符合要求，那么本次实验结果 有效 无效。四、结果断定1、标准规定：N/A2、检验结果：3、检验结论： 符合规定 不符合规定 复检 N/A五、备注1、附检测图谱共页。2、以下无内容操作人/日期：复核人/日期：十二烷基硫酸钠

25、毛细管凝胶电泳法 CE-SDS 法测定记录适用于多个样品品名批号/编号规格开检日期年月日检验根据一、实验材料1、试药与试液名称编号/批号来源系统适用性样品 SDS凝胶别离缓冲液稀释液 SDS样品缓冲液碱性清洗液 0.1mol/L 氢氧化钠溶液酸性清洗液 0.1mol/L 盐酸溶液Internal Standard kD2-巯基乙醇碘乙酰胺溶液 0.25mol/L 复溶溶剂灭菌注射用水原液缓冲液 成品缓冲液 2、仪器与用具名称消费厂家 /型号设备编号毛细管电泳仪 AB SCIEX / PA 800plus AB SCIEX / CESI 8000 Plus水浴锅 上海精宏实验设备 /DKB-50

26、1S 其它第 1 页/共 5 页金属浴 Thermo/Digital Cooling Drybath 其它台式高速冷 冻离心机 Eppendorf/Centrifuge 5418R 其它Uncoated CapillaryAB SCIEX 内径 m，有效别离长度： 号： ，毛细管编号：cm，毛细管批二、操作步骤1、供试品前处理：2、待测样品和样品缓冲液稀释样品名称蛋白质浓度mg/ml稀释过程稀释 倍数蛋白质终浓 度 mg/ml3、供试品溶液制备非复原供试品溶液制备：分别取稀释后样品溶液各 ，l各参加 10kDaInternal Standard ，l再各参加 0.25mmol/L 碘乙酰胺溶液

27、 ，l涡旋混 匀后在 孵育 分钟。复原供试品溶液制备：分别取稀释后样品溶液各 ，l各参加 10kDaInternal Standard ，l再各参加 2-巯基乙醇 ，l涡旋混匀后在 孵育 分钟4、将制备好的供试品溶液冷却至室温后以每分钟6000 转离心 1 分钟。从样品管中分别取出样品至 200l微量管中，将 200l微量管放入 CE通用样品瓶中， 盖 好蓝色橡胶通用样品瓶瓶盖，放置样品盘中待分析。5、缓冲液瓶的准备：SDS凝胶别离缓冲液分别加 1.2mlB列与 1.1mlC列，超纯水、酸性清洗液及碱性清洗液分别加 1.5ml，废液瓶中参加超纯水 0.8ml 按照下列图位置放入相应的缓冲液瓶。别离方法：高分辨率方法 高效方法入口缓冲液，放置于 侧缓冲液托盘入口缓冲液摆放见下列图出口