PCR的临床应用知识

1、基本原理基本原理 n以以dna为例为例 n（1）dna变性变性： n（2）降温退火：）降温退火： n（3）引物延伸）引物延伸： 1 12 23 34 45 5 2222 5555 7272 9494 时间（时间（minmin） 温度温度 （） pcrpcr的基本原理的基本原理 pcrpcr反应条件反应条件 pcrpcr过程过程 pcrpcr的特点的特点 适温延伸适温延伸 3 3 高温变性高温变性 1 1 低温退火低温退火 2 2 重复重复1313步步 25302530轮轮 目的目的dnadna片段片段 扩增扩增100100万倍以上万倍以上 dnadna双螺旋双螺旋 dnadna单链单链 与引物

2、复性与引物复性 dnadna变性 变性 形成形成2 2条单链条单链 子链延伸子链延伸 dnadna加倍加倍 原理原理 第一步第一步 加热变性加热变性 n预处理 第二步第二步 引物与靶序列退火引物与靶序列退火 第三步第三步 - - 引物延伸引物延伸 第第1 1个个 pcr pcr 循环完成后循环完成后 得到两个拷贝的靶序列得到两个拷贝的靶序列 3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量 no. ofno. amplicon cycles copies of target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824 30次循环扩增

3、后可达次循环扩增后可达10亿的基因片段亿的基因片段 pcrpcr技术的特点技术的特点 灵敏灵敏度高度高 特异特异性强性强 快速快速简便简便 应用应用范围广范围广 临床应用 n肝炎病毒(hbv、hcv) n优生优育优生优育(hcmvhcmv、toxtox、rvrv、hsvihsvi、hsviihsvii) n性病病原体性病病原体(ct、uu、ngh、 hpv、 tp) n呼吸道病原体呼吸道病原体(tb、mp、cp、sars、 h1n1) n其他病原体其他病原体(eb、hp、ev71、ev、 cox a16) 肝炎病原体检测的意义肝炎病原体检测的意义 nhbv、hcv 1、了解肝炎病毒在体内存在的

4、了解肝炎病毒在体内存在的数量数量。 传染？传染？复制？复制？治疗？治疗？ 2、肝功能异常是否由肝炎病毒引起？早、肝功能异常是否由肝炎病毒引起？早 期诊断期诊断 （窗口期窗口期）的感染者。）的感染者。 3、基因分型可选、基因分型可选抗病毒药物抗病毒药物 。（选用分型试剂）。（选用分型试剂） 4、判断药物治疗的、判断药物治疗的效果效果。 5、进行、进行hbv分子流行病学研究。分子流行病学研究。 乙肝dna与肝功的关系 n1.乙肝dna报告单所描述的结果是代表 在送检的样本中检测到乙肝病毒的遗传 物质（dna）。 n2.乙肝dna阳性与阴性与肝功能没有直 接关系。 n3.用辩证的思维理解每一份检测结

5、果。 不合格标本带来的后果不合格标本带来的后果 标本不合格标本不合格 结果不准确结果不准确 诊断错误诊断错误 治疗错误治疗错误 70% 耽误治疗耽误治疗 pcr结果单位的换算 3.5e+005 iu/ml(3.5105基因基因/拷贝拷贝)-表表 示一毫升血清中有示一毫升血清中有35万个万个hbv病毒微粒。病毒微粒。 hbvdna的变化的变化 在患者治疗过程中检测在患者治疗过程中检测hbvdna定量，定量， 一般认为：其结果相差一般认为：其结果相差5倍属正常波动，倍属正常波动， 结果相差降低结果相差降低10倍以上才算治疗有效。倍以上才算治疗有效。 例如例如1 n有一患者治疗前检测有一患者治疗前检

6、测hbv-dna定量为定量为 8.8e+006 iu/ml，治疗一月后复查为，治疗一月后复查为 2.3e+007 iu/ml，两结果相差，两结果相差2.6倍。倍。 （不一定是高了？）（不一定是高了？） 如何向病人解释：如何向病人解释： 属正常波动或者检测误差属正常波动或者检测误差（允许误差）（允许误差） 例如例如2 一患者治疗前检测一患者治疗前检测hbv-dna定量为定量为 9.2e+006 iu/ml；治疗一月后复查为；治疗一月后复查为 2.8e+006 iu/ml，两结果相差，两结果相差3.3倍，不倍，不 能说明治疗有效，需要继续观察。要有能说明治疗有效，需要继续观察。要有 明显的下降明显的下降趋势趋势。 pcr技术的新认识技术的新认识 n pcr 技术诞生以来，应用广泛，同时技术诞生以来，应用广泛，同时 不断发展与完善，不断发展与完善，解决了解决了以往以往pcr 的的瓶瓶 颈问题：灵敏度、假阳性颈问题：灵敏度、假阳性。 n 防污染问题：假阳性防污染问题：假阳性的解决。它将作为的解决。它将作为 常规检验方法进行全面普及，发挥