干细胞培养全攻略

1、For personal use only in study and research;not for commercial use羁ES细胞培养螂A.FBS的灭活与分装芆1.化冻袇将血清(Fetal Bovine Serum, Hyclone )从20C冰箱取出，放于 4C冰箱化冻过夜; 也可室温(或浸于自来水中)化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4 C冰箱暂时保存；羁2.灭活(1)(2) 罿放入室温的水浴锅内开始加热(同时放入一个内装200 ml自来水的血清瓶，插入 一根温度计，温度监控以此为准)；(3)(3) 肇当温度计显示56C时，控制在此温度 30分钟土 3分钟；若不小心使温度上升超

2、过 56 C，则：若仍未超过 60 C，且时间很短(比如：不超过 5分钟)，则仍可使用； 若超过60C，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于ME细胞的培养；(2)(3) 薆取出，自然冷却至室温(约需 1 3小时)，可分装或20 C继续冻存；肁3.分装荿(1)转入细胞间，用移液器将血清分装，注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀；吹出 血清时要注意：不要吹出气泡(血清很粘稠，很容易产生气泡；如果已产生气泡，则 在酒精灯火焰上过一下)；标好批号和日期；蝿(2)放入20 C冰箱冻存(分装一次大约可以使用 1 2个月)。莄B配制DME血清培 养基賺1.提前一天将分装好的 FBS从一20C冰箱取出，放于

3、4C冰箱化冻；螀2.在细胞间中将 FBS以及其它需要添加的成分（如，丙酮酸钠、抗生素等），按照比例加入DMEM培养基中，作好标签；放入 4C冰箱保存。腿配制比例如下：膃50ml体积的干细胞培养液配制-+- 芁賺衿 DME( High glucose ) /DMEM培养基(高糖膆莀芈谷氨酰胺（）莇 50ul羅蒀非必需氨基酸虿 500ul聿螄丙酮酸钠螄 500ul肀薇B-巯基乙醇螇？袄蒁双抗艿 50ul节蚀血清蚈 7.5ml蒂肀LIF螀5ul螄膄蝿袀膅C.原代胚胎成纤维细胞（ME的制备薂1.取12.5-13.5dpc 孕鼠，断颈处死；袂2.将鼠腹面向上放置，70%酒精润湿、消毒腹部（防止腹毛飞扬，

4、污染内脏及子宫），剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入 无菌10cm平皿中；羀3.把平皿转入超净台；薆4.用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及 各种内脏（主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等）；莄5将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次；薁6.弃去PBS用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色（1 4 次）;聿7.加入适量Trypsin-EDTA （0.25% Gibco 25520，下同），体积约等于组织块体积；羇8. 用滴管轻轻吹匀，室温下消化 1 1 0分钟（或消化至溶液浑浊变粘） ，加入与消化液等 体

5、积培养基，轻轻吹打混匀（ 510次），静置；螂 9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。莀10. 将细胞悬液管离心（ 1000转 5分钟）；聿11.弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签（ME- 0;注意：若冻存，则可以使用复苏后的 0代ME制作Feeder; 若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好），转入培养箱培养；肄12. 视细胞生长情况换液（一般 3 天换液一次） ，若细胞已长满，则冻存，或者 1： 3-5 传 代（视细胞疏密而定），放入培养箱继续培养（此后不用再换液

6、）；1 5代的ME细胞均可用来制作 Feeder。蒄饲养层细胞（Feeder）的制备腿注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基（FBS占10%）（实验室所用 MM（为10 mg/mL, Calbiochem ）腿1.弃去细胞培养皿中的培养液， 加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基（DMEM+10FBS）;蒅2. 放入培养箱培养 3小时（ 24小时）；羂3. 用 0.1% 明胶处理培养皿 （将明胶加入, 摇动使明胶覆盖全部皿底, 然后吸出明胶弃去 即可）,室温放置 2 小时以上,至皿底明胶干燥为止；膂4.弃去含有丝裂霉素 C的培养基，加入 2 3 mL PBS,轻轻摇动，弃去

7、PBS如此洗3-5 次（必须洗 3 次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对 ES细胞有毒性）;24. 加入适量胰酶消化 30 秒,吸去消化液,静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止,加入 培养基,吹打, 种至明胶处理过的培养皿中即可（如细胞过稀,可再补加丝裂霉素处理过的 细胞），半小时后即可使用（如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上） ,可使用 610天,用前更换培养液（如未用明胶处理培养 皿，则需在培养箱中放置 2小时以上方可使用；最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于 ES

8、细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题,还可以赶紧补做） 。ES细胞培养基DMEM+15%FBS2- 巯基乙醇： 5.5uM1000XGibco 21985-023L- 谷氨酰胺： 2mM100XLIF ：1000U/mL10000X非必需氨基酸： 100uM100XSigma G8540Chemicon ESGRO? (LIF); 10E7 units ，货号 :ESG1107Gibco 11140-050双抗：100XGibco 15070-063ES细胞的复苏1. 提前制备好相应数量的 Feeder ；2. 准备37- 39C的热水，从液氮罐中取出所需冻存管（冻

9、存细胞），迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化；3. 转入无菌间， 1000转/ 分钟离心 5-10 分钟；4. 弃上清，加入 1 ml ES 培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中（冻存前 细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿） ，补加适量培养液；5. 转入培养箱培养，次日换液；此后每 24 小时换一次液，每 48 小时传一次代（视生长情 况）。ES细胞的换液1. 提前半小时左右将培养基从 4C冰箱取出，放于室温（或者放于37C温箱内）；2. 细胞培养皿从培养箱内取出，相差显微镜下作常规观察（判断生长情况，并确证未发生 污染）后转入无菌操作台内；3. 将ES细

10、胞培养皿内的液体吸出、弃去，换新鲜培养基（6 cm培养皿约5 mL, 3.5 cm培养皿约3 mL培养基；若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基）；4. 放回培养箱继续培养。ES细胞的传代1. 前一天下午做好所需数量的 Feeder 细胞板；2. 提前半小时左右将培养基从 4C冰箱取出，放于室温（或者放于37C温箱内）；3. 将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出 （相差显微镜下作常规观察，Feeder细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养皿面积）；ES细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均匀，集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表 面

11、光滑，细胞生长致密、核大、胞质少；4将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用约 30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去；再作用15分钟，不时观察，待细胞层（皿底一层白色脏东西样膜） 出现裂缝并明显开始下滑时，补加培养基，适度吹打（视消化程度 及管口粗细而定，至看不到明显的大的细胞团块为止）；平均分到 Feeder 培养皿中（滴加，以免将 Feeder 细胞吹脱落下来） ，滴加补加培养基至 5 ml 左右（滴加，以免将 Feeder 细胞 吹脱落下来；若为 3.5cm 培养皿，则补加至 3ml 左右），作好标签；5. 前后左右水平晃动培养皿，使ES细胞

12、均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。ES细胞的冻存1. 常规方法将细胞消化成单细胞悬液；2. 转入试管， 1000转/分钟离心 5分钟；3. 配适量冻存液（为含 10%二甲亚砜（DMSO, 10% FBS的DMEM培养液）；4. 弃上清，每管加入1ml冻存液，吹打成细胞悬液（只要使ES细胞分散成35个细胞的 小团块即可） ，转入冻存管，作好标签；5. 放入程序冻存盒内 24 小时后转入液氮罐中冻存。仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r

13、 den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.to员bko gA.nrogeHKO TOpMenob3ymm aoadyHeHuac egoB u HHuefigoHMucno 员 B30BaTbCEb KOMMepqeckuxqe 员 ex.以下无正文For personal use only in study and research; not for commercial use仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecke