第十三章色谱法基础Anintroductiontochromatography

1、chromatogram analytical method generality 第7章 色谱分析法概论 7.1 概述 7.2 色谱过程与术语 7.3 色谱分离的基本理论 7.4 基本类型色谱法的分离机制 7.5 色谱法的发展趋势 7.1概述 7.1.1色谱法的起源和发展 1906年，俄国植物学家 M.Tswett 发表了他的 实验结果：为了分离植物色素，他将含有植 物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末 的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由 于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不 同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的 速度不同，从而形成一圈圈不同颜色的色带， 使各色素成分得到了分离。他

2、将这种分离方 法命名为色谱色谱法(chromatography)。在此后的 20多年里，几乎无人问津这一技术。到了 1931年，Kuhn 等用同样的方法成功地分离了 胡萝卜素和叶黄素，从此色谱法开始为人们 所重视，相继出现了各种色谱方法。 俄国植物学家 茨维特 7.1概述 7.1.1色谱法的起源和发展 Tswett植物色素分离实 验图示： l样 品：植物色素 l固定相：CaCO3颗粒 l流动相：石油醚 流动相 石油醚 混合色素 叶绿素 叶黄素 胡萝卜素 分离组分 色谱柱 固定相 碳酸钙 表7-1 色谱法的发展简史 年代发明者发明的色谱方法或重要应用 1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物

3、色素。最先提出色谱概念。 1931Kuhn, Lederer用氧化铝和碳酸钙分离-,-,-胡萝卜素。色谱法受重视。 1938 Izmailov, Shraiber最先使用薄层色谱法。 Taylor, Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。 1941Martin, Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气相色谱。 1944Consden等等发明了纸色谱。 1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段 1952Martin, James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。(1952诺贝尔奖) 1956Van Deemter等等提出色谱

4、速率理论，并应用于气相色谱。 1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 1958Golay发明毛细管柱气相色谱。 1959Porath, Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。 1964Moore发明凝胶渗透色谱。 1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 1975Small 发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型 电导检测的新型离子色谱法。 1981Jorgenson等等创立了毛细管电泳法。 表7-2 色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作 年代获奖学科获奖研究工作 1937化学胡萝卜素化学，维生素A和B 1938化学胡萝卜素化学 193

5、9化学聚甲烯和高萜烯化学 1950生理学医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离 1951化学超铀元素的发现 1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素 1958化学胰岛素的结构 1961化学光合作用时发生的化学反应的确认 1970 生理学医学关于神经元触处迁移物质的研究 化学发现糖核苷酸及其在生物合成碳水化合物中的作用 1972 化学核糖核酸化学酶结构的研究 生理学医学抗体结构的研究 v1906，俄国植物学家 M.Tswett 发明色谱法，色谱之父 v1931，对液固吸附色谱的杰出贡献者库恩，分离出60多 种胡萝卜素，核黄素、维生素，获1938年诺贝尔化学奖 v蒂塞利乌斯(Tisel

6、ius)因电泳分析和分析方法的研究，发 现血清蛋白组分，获1948年诺贝尔化学奖 v1941，马丁(Martin)和辛格(Synge)创始分配色谱特别是 纸色谱而共获1952年诺贝尔化学奖 v氨基酸自动分析仪发明人S.穆尔(Stanford Moore)和W.H. 斯坦(William Howard Stein),定量分析方法解决了有关氨 基酸、多肽、蛋白质等复杂的生物化学问题，获1972年 诺贝尔化学奖 1. 色谱法的定义 色谱法又称色层法或层析法，是一种物理化学分析 方法，它利用不同溶质(样品)与固定相和流动相之 间的作用力(分配、吸附、离子交换等)的差别，当 两相做相对移动时，各溶质在两

7、相间进行多次“平 衡”，使各溶质达到相互分离。 固定相：在色谱分离中固定不动，对样品产生保留 的一相。 流动相：带动样品向前移动的另一相，与固定相处 于平衡状态。 7.1概述 7.1.2色谱法的定义与分类 2. 色谱法的分类 根据流动相的状态将色谱法分成四大类。 表17-3 色谱法以流动相种类的分类 色谱类型流动相主要分析对象 气相色谱法气体挥发性有机化合物 液相色谱法液体溶于水或有机溶剂的各种物质 超临界色谱法超临界流体各种有机化合物 电色谱法缓冲溶液、电场离子和各种有机化合物 7.1概述 7.1.2色谱法的定义与分类 1.按两相分子的聚 集状态分类 2. 按固定相的固 定方式分类 平面色谱

8、 纸色谱 薄层色谱 高分子薄膜色谱 柱 色 谱 填充柱色谱 毛细管柱色谱 分配色谱： 利用分配系数的不同 吸附色谱： 利用物理吸附性能的差异 离子交换色谱：利用离子交换原理 空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同 3. 按分离机制 分类 流动相 固定相 类型 液体 固体 液-固色谱 液体 液体 液-液色谱 气体 固体 气-固色谱 气体 液体 气-液色谱 液相色谱 气相色谱 7.2色谱过程与术语 7.2.1色谱过程 7.2.2基本术语 7.2色谱过程与术语 7.2.1色谱过程 色谱过程是物质分子在相对运动的两相间分配平衡 的过程。在混合物中，若两个组分的分配系数不等， 则被流动相携带移动的速率不等，

9、即形成差速迁移 而被分离。如图所示。 7.2色谱过程与术语 7.2.1色谱过程 v色谱过程的实质 (1)色谱过程是吸附与解 析的过程； (2)不同组分极性的差异 导致吸附与解析的差 异； (3)不同组分向前移动的 过程是差异不断累积 过程，是在动态中由 量变到质变的过程。 B A A B B A B B AB AB c t 流动相 样品液 色谱柱 固定相 检测器 7.2色谱过程与术语 7.2.2基本术语 1.色谱 2.保留值 3.分配系数(K)和容量因子(k) 4.分离参数 7.2色谱过程与术语 7.2.2基本术语1.色谱 检测色谱分离后组分的响应信号对时间作图得到的 曲线称为色谱图。 图7-

10、2 色谱流出曲线 A O A E G F H 进样 空气峰 C I D J t B h 2 1h.6670 h 2 21/ W W 0 t R R t t 信号 O 0 7.2色谱过程与术语 7.2.2基本术语1.色谱 名词术语：色谱峰、基线、峰高h、标准偏差、峰 宽W、半峰宽W1/2、峰面积A； 包含信息：tR；h或A；,W1/2,W 。 关系：W=4，W1/2=2.355，W=1.699W1/2， A O A E G F H 进样 空气峰 C I D J t B h 2 1h.6670 h 2 21/ W W 0 t R R t t 信号 O 0 7.2色谱过程与术语 7.2.2基本术语2

11、.保留值 0 174 310 373.4 t(mm) V m 进进 样样 C7 未未 知知 C8 )()1( )()( lglg lglg 100 zRzR zRxR x tt tt ZI 例如求乙酸正丁酯在柱温为100的阿皮松L柱上的保留指数. 正庚烷(C7)：tR(Z)174.0mm，lg174.02.2406； 乙酸正丁酯：tR(x)310.0mm，lg310.02.4914； 正辛烷(C8)： tR(Z+1)373.4 mm，lg373.42.5722。 代入公式，求得I775.6，说明乙酸正丁酯在柱上的保留行为 相当于7.756个碳原子正构烷烃的保留行为。 7.2色谱过程与术语 7.

12、2.2基本术语2.保留值 7.2色谱过程与术语 7.2.2基本术语3.分配系数(K)和容量因子(k) 分配系数(K)：色谱过程中，在流动相和固定相中的 溶质分子处于动态平衡。平衡时组分在固定相(s)与 流动相(m)中的浓度(c)之比，称为分配系数(K)。 m s c c K 分配系数的物理意义：表示平衡态下，组分在固定 相和流动相的浓度之比，也叫做分配平衡常数。其 中，在吸附色谱中称为吸附系数(Ka)；在离子交换色 谱中称为选择性系数(Ks)；在凝胶色谱中称为渗透系 数(Kp)。分配系数的差异是所有色谱分离的实质性的 原因。 7.2色谱过程与术语 7.2.2基本术语3.分配系数(K)和容量因子

13、(k) 容量因子(k) ：在平衡状态下，组分在固定相(s)与 流动相(m)中的质量之比，称为容量因子。色谱柱的 容量因子是溶质分子与色谱柱填料相互作用强度的 直接量度，由下式定义： )()1 ( - BA00 00 0 m s mm ss kkttktt t t t tt k V V K Vc Vc k RR RR ， ， 7.2色谱过程与术语 7.2.2基本术语4.分离参数 分离因子()：即相邻两个组分调整保留值之比，又 称为分配系数比或选择性系数比。 分离度 (Rs)：相邻两个组 分的色谱峰，其保留时间 差与两峰峰底宽平均值之 商。 ; 1 2 1 2 1 2 1 2 K K k k V

14、V t t R R R R 。 12 2 1 12 WW tt R RR s 7.2色谱过程与术语 7.2.2基本术语4.分离参数 v色谱分析的目的就是要将混合物中的各组分分离， 为了获得较好的准确度，一般规定两相邻峰的分离 度 Rs1.5时，可认为两组分完全分离。 7.2色谱过程与术语 7.2.2基本术语例题17-1 一个气相色谱柱，由固定液的涂量及固定液在柱温下的密度计 算得Vs14.1mL，载气流速为43.75mL/min。分离一个含A、B、 C三组分的样品，测得组分保留时间分别为1.41min、2.67min、 4.18min、空气为0.24min。试计算：死体积；各组分的调 整保留时

15、间；相邻两组分的分离因子。 解解：已知Fc 43.75mL/min，死时间t00.24min。 。，相邻峰的分离因子为： 。，得： ，将数据代入公式：积忽略检测器及接头的体 。，因 62. 108. 2 2 .1254. 763. 3 )(3 min94. 3min43. 2min17. 12 mL5 .1075.4324. 01 0 0 0 0 B C BC A B AB CBA s mR s m m s m RRRRR K K K K KKK V V t t V V k c c K VV tttttt V CBA 7.3色谱分离的基本理论 7.3.1 分配系数与保留行为的关系 7.3.2

16、等温线 7.3.3 塔板理论 7.3.4 速率理论 7.3.5 影响分离度的因素 7.3色谱分离的基本理论 7.3.1分配系数与保留行为的关系 推导色谱过程方程： 在实验条件一定时，保留时间tR取决于分配系数K， 也就是取决于组分的性质，所以，保留时间是对组 分进行色谱定性的指标。 m s R R m s mm ss V V Ktt ktt V V K Vc Vc k 1 1 0 0 色谱过程方程： ，保留时间： ，容量因子： Vs固定相的体积 Vm流动相的体积 K,tR,组分后出柱 K0， 组分不保留 K,组分完全保留 7.3色谱分离的基本理论 7.3.2等温线 等温线： 在一定温度条件下，

17、组分在固定相和流动相的分配 达到平衡时，在两相中的浓度之比值K为常数，由 此绘制出的cs与cm的关系曲线称为等温线。 a K=cs/cm b c cs cm tR c b前延峰 a正常峰 c拖尾峰 7.3色谱分离的基本理论 7.3.2等温线 对称因子： u完全对称：fs=1.00 u对称峰：fs=0.951.05 u前沿峰：fs0.95 u拖尾峰：fs1.05 图7-5 对称因子的计算 A BA A W f h s 22 05. 0 Wh/2h 0.05h W0.05h AB 1.塔板理论的基本假设 2.塔板理论的计算公式 3.塔板理论的优点和局限 7.3色谱分离的基本理论 7.3.3塔板理论

18、 7.3色谱分离的基本理论 7.3.3塔板理论1.塔板理论的基本假设 v色谱柱是由一系列连续、等距的水平塔组成，在 柱内每层塔板内部，组分能够在流动相和固定相 两相中达到平衡。 v流动相通过色谱柱呈间歇式前进运动，每次前进 为一个塔板体积。 v样品和流动相同时加在第一个塔板上，且样品垂 直于前进方向的扩散(即纵向扩散)可以忽略。 v分配系数在各塔板上是常数。 7.3色谱分离的基本理论 7.3.3塔板理论1.塔板理论的基本假设 塔板理论的这些假设，实际上是把组分在两相间的 连续转移过程，分解为间歇地在单个塔板中的分配 平衡过程，经过多次分配平衡后，分配系数小的组 分先达到塔顶(即挥发性大的组分先

19、流出色谱柱)。 色谱柱的塔板数可高达几千甚至几万，使被测组分 在分配系数间有微小的差别时就可以得到分离。 7.3色谱分离的基本理论 7.3.3塔板理论1.塔板理论的计算公式 理解：在tR一定时，W或W1/2 越小(即峰越窄)，理论板数n越 大， 理论板高越小，柱的分离 效率越高。有效理论塔板neff也 同此理。因此，理论塔板数是 评价柱效能的指标。 。 ； ； ； ； 2 2/1 22 2 2/1 22 2 54. 516 54. 516 W t W t t n W t W t t n n L H H L n L H RRR eff RRR eff eff 推导有效理论塔板数： 推导理论塔板数

20、： 有效理论板高： 理论塔板数： 理论板高： 7.3色谱分离的基本理论 7.3.3塔板理论3.塔板理论的优点和局限 优点：塔板理论是半经验性理论，在解释流出曲线 的形状、浓度极大点的位置、评价柱效高低等方面 是成功的。 局限：塔板理论的基本假设与事实不完全相符，它 无法解释谱带扩展的原因，也无法解释色谱过程与 流动相流速、柱内分子扩散传质过程以及色谱操作 参数等动力学因素的关系。 这些问题，在速率理论中得到了圆满的解决。 为了克服塔板理论的缺陷，Van Deemter等在Martin等人的工作 基础上，比较完整地解释了速率理论。后来，Giddings等又作 了进一步的完善。速率理论充分考虑了溶

21、质在两相间的扩散 和传质过程，更接近溶质在两相间的实际分配过程。 当溶质谱带向柱出口迁移时，必然会发生谱带展宽。谱带的 迁移速率的大小决定于流动相线速度和溶质在固定相中的保 留值。同一溶质的不同分子在经过固定相时，它们的迁移速 率是不同的，正是这种差异造成了谱带的展宽。谱带展宽的 直接后果是影响分离效率、降低检测灵敏度，所以，抑制谱 带展宽就成了高效分离追求的目标。 引起谱带展宽的主要因素有：涡流扩散；纵向扩散； 传质阻力。这些因素都统一于Van Deemter方程中。 7.3色谱分离的基本理论 7.3.4速率理论 7.3色谱分离的基本理论 7.3.4速率理论 Van Deemter方程 BC

22、AH Cu u B AH 2 最小 符号名 称单位 H塔板高度cm A涡流扩散项cm B纵向扩散系数cm2s-1 C传质阻力系数 s u载气线流速cms-1 图17-6 范氏方程中各项对板高的贡献 0 t L u Van Deemter方程方程中各项的意义 符号名称关系式备 注 A 涡流扩散项 (多路径项) A=2dp dp：固定相颗粒平均直径；： 涡流扩散因子，与填充的均匀性 有关 B/u 纵向扩散项 (分子扩散项) B=2rDg r ：曲折因子，反映固定相颗粒 的空间结构。填充柱r0.5-0.7, 空心柱r1；Dg ：组分分子在 载气中的扩散系数 Cgu 气 相 传质阻力项 k：容量因子

23、Clu 液 相 传质阻力项 df ：固定液液膜厚度， Cl： 组分在固定液中的扩散系数 g p g Dk dk C 2 22 1 01. 0 () l f l D d k k C 2 22 +1 8 = 7.3色谱分离的基本理论 7.3.4速率理论引起谱带展宽的主要因素 引起谱带展宽的主要因素 (1)涡流扩散 (2)纵向扩散 (3)传质阻力 7.3色谱分离的基本理论 7.3.4速率理论引起谱带展宽的主要因素 (1)涡流扩散：引起涡流扩散的原因是色谱柱内的 多路径。溶质分子在前进过程中形成的这种紊乱 类似于涡流的流动，所以称之为涡流扩散。 A=2dp v空心毛细管柱无多径相：A0 A B C 柱

24、管壁 固定相 组分移行轨迹 初始带宽谱带展宽 流动相方向 7.3色谱分离的基本理论 7.3.4速率理论引起谱带展宽的主要因素 (2)纵向扩散：引起纵向扩散的原因是浓度梯度。纵向扩散 是溶质分子在移动方向上向前和向后的扩散，引起谱带 展宽。它是由浓度梯度所引起。纵向扩散引起的峰展宽 由下式决定： 纵向扩散引起的色谱峰展宽示意图 u D u B g 2 v式中B2Dg，为纵向扩散系数；为弯曲因子或阻碍因子， 填充柱0.50.7，毛细管1；Dg为溶质在流动相中的 扩散系数；u 为流动相线速度。随着样品带在固定相中的 移动，因纵向扩散使样品带宽逐渐增加，相应得到的色谱 峰就越来越宽而矮。 7.3色谱分

25、离的基本理论 7.3.4速率理论引起谱带展宽的主要因素 (3) 传质阻力引起的扩散 传质阻力系数C，是溶质在固定相中传质阻力系数 (Cl)与流动相(气相)传质阻力系数(Cg)之和： CClCg 流动相传质阻力引起的扩散溶质分子要从流动相 转移到固定相中，就要从流动相主体扩散到气液、 气固、液液或液固界面，阻碍这一扩散过程 的阻力称流动相传质阻力。流动相传质阻力引起的 谱带展宽程度由下式决定： g p g Dk dk C 2 22 1 01. 0 7.3色谱分离的基本理论 7.3.4速率理论引起谱带展宽的主要因素 (3) 传质阻力引起的扩散 固定相传质阻力引起的扩散溶质分子到达两相界 面后，将继

26、续扩散到固定相内部达到分配平衡，然 后又返回到两相界面。溶质在这一移动过程中的阻 力称固定相传质阻力。固定相传质阻力引起的谱带 展宽由下式决定： l f l D d k k C 2 22 )1 ( 8 7.3色谱分离的基本理论 7.3.4速率理论 结论： Van Deemter方程说明了色谱柱填充均匀程度、 载体的性质与粒度、载气种类与流速、固定液层厚、柱 温等对柱效的影响，对分离条件具有指导意义。 g g D r k kk C 2 0 2 2 )1 (24 1161 l f l D d k k C 2 2 )1 ( 3 2 u D dC D dC D dC u DC dH m psm s f

27、s m pm md p 222 2 Giddings方程(液相色谱) Golay方程(空心柱气相色谱) uCuC u B H lg 7.3色谱分离的基本理论 7.3.5影响分离度的因素 c b a 1 1 4 2 2 s k kn R A B BA B B A A 原始 状态 增加 k 增加 n 增加 7.3色谱分离的基本理论 7.3.5影响分离度的因素 在保持色谱条件不变的 情况下，从分离度方程 式可以推导出柱长与分 离度的关系式 2 1 2 2 1 L L R R 7.4基本类型色谱法的分离机制 7.4.1吸附色谱法 7.4.2分配色谱法 7.4.3离子交换色谱法 7.4.4空间排阻色谱法

28、 7.4基本类型色谱法的分离机制 7.4.1吸附色谱法 吸附色谱法利用固体吸附剂作为固定相，最常用的固定 相是硅胶。它利用被分离组分对固定相表面活性中心吸 附能力的差别而实现分离。 吸附平衡： Xm + nYa Xa + nYm mX aX n am n ma a Vn Sn YX YX K m a 吸附系数： 常数 分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心， 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离。 过程：吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分离 m X m Y ma a X 图710 吸附色谱示意图 X.溶质分子溶质分子 Y.流动相分子流动相分子 a. 吸附剂吸附剂 m.流动相流动相 7.4基本类型色谱法的分离机制 7.4.1吸附色谱法 要求：固定相机械吸附在惰性载体上的液体；流动相 必须与固定相不为互溶；载体惰性，性质稳定，不 与固定相和流动相发生化学反应。分离机制：见图示 狭义分配系数狭义分配系数 mX sX m s Vn Vn C C K m s n 注：K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以 及柱温有关。 中的体积分别为固定相与流动相 相与流动相中的浓度分别为溶质分子在固定 ms ms VV CC 、 、 7.4基本类型