细胞工程植物细胞培养

1、第四章第四章 植物细胞培养植物细胞培养 植物细胞培养（植物细胞培养（plant cell cultureplant cell culture）是指）是指 在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行 培养使其增殖的技术。培养使其增殖的技术。 根据培养规模：小规模培养和大批量培养；根据培养规模：小规模培养和大批量培养； 根据培养方式：悬浮培养、单细胞培养等；根据培养方式：悬浮培养、单细胞培养等； 根据要求产物：用于诱变的细胞培养和生产根据要求产物：用于诱变的细胞培养和生产 次生产物的细胞培养。次生产物的细胞培养。 第五章第五章 植物细胞培养植物细胞培养 4

2、.1 单细胞分离单细胞分离 4.3 单细胞培养技术单细胞培养技术 4.2 悬浮培养悬浮培养 4.4 细胞培养与次生产物生产细胞培养与次生产物生产 由完整的植物器官分离单细胞由完整的植物器官分离单细胞 由培养组织中分离单细胞由培养组织中分离单细胞 4.1 单细胞分离单细胞分离 叶片是分离单细胞的最好材料叶片是分离单细胞的最好材料 (1)(1)机械法机械法 (2)(2)酶解法酶解法 4.1.1 由完整的植物器官分离单细胞由完整的植物器官分离单细胞 撕去下表皮撕去下表皮 露出叶肉细胞露出叶肉细胞 用解剖刀刮下细胞用解剖刀刮下细胞 (1) 机械法机械法 用刀片刮叶片用刀片刮叶片 叶片研碎、离心叶片研碎

3、、离心 研碎匀浆研碎匀浆 加研磨介质加研磨介质 过滤、离心过滤、离心 (1) (1) 机械法机械法 只有薄壁组织排列松只有薄壁组织排列松 散，细胞间接触点很散，细胞间接触点很 少时用机械法分离叶少时用机械法分离叶 肉细胞才能取得成功。肉细胞才能取得成功。 takebe takebe等（等（19681968）最早报道：用果胶酶处理）最早报道：用果胶酶处理 可以分离大量的叶肉细胞可以分离大量的叶肉细胞 (2) (2) 酶解法酶解法 加果胶酶加果胶酶 过滤、离心过滤、离心 (1) (1) 诱导产生愈伤组织；诱导产生愈伤组织； (2) (2) 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织反复继代，使

4、组织不断增殖，提高 愈伤组织的松散性；愈伤组织的松散性； 4.1.2 由培养组织分离单细胞由培养组织分离单细胞 步骤：步骤： 茎段茎段 摇床用于振荡摇床用于振荡 继代继代 悬浮悬浮 15ml medium/1g 120rpm culture transfer 1time/3d 3 weeks 100-130目网过滤目网过滤 centrifuge( (离心）离心）isolation (3) (3) 将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物 选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最 常使用的外植体。常使用的外植体。

5、 选择适宜的培养基：较高激素浓度，特别是选择适宜的培养基：较高激素浓度，特别是 生长素，必要的附加物质，例如水解酪蛋白、生长素，必要的附加物质，例如水解酪蛋白、 propro、glngln。 继代多次，以获得均匀一致疏松的愈伤组织。继代多次，以获得均匀一致疏松的愈伤组织。 注意注意 悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮 在液体培养基中进行培养增殖的技术。在液体培养基中进行培养增殖的技术。 4.2 细胞悬浮培养细胞悬浮培养 4.2.1 细胞悬浮培养的概念和意义细胞悬浮培养的概念和意义 bioreactor for continuous cell suspe

6、nsions shaker for suspension culture culture wheel (1)(1)细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞 群体，适于大规模培养；群体，适于大规模培养； (2)(2)能够提供大量较为均匀的细胞，为研究能够提供大量较为均匀的细胞，为研究 细胞的生长、分化创造方法和条件。细胞的生长、分化创造方法和条件。 4.2.1 细胞悬浮培养的概念和意义细胞悬浮培养的概念和意义 cell suspensionplantsartificial seeds secondary products isolation protoplastsmu

7、tation select 4.2.2 细胞悬浮培养的应用细胞悬浮培养的应用 (1)(1)培养基培养基 对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的培养对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的培养 基以原愈伤组织继代时的培养基除去琼脂为好。基以原愈伤组织继代时的培养基除去琼脂为好。 为了提高细胞的分散度，对于生长素和细胞分裂为了提高细胞的分散度，对于生长素和细胞分裂 素的比例需要进行一些调节。素的比例需要进行一些调节。 4.2.3 细胞悬浮培养的方法细胞悬浮培养的方法 最低有效密度的概念最低有效密度的概念 在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细胞能够增在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细胞能够增 殖的最少接种量称为最低有效

8、密度或者临界的起殖的最少接种量称为最低有效密度或者临界的起 始密度。始密度。 最低有效密度由于培养材料、原种培养条件，最低有效密度由于培养材料、原种培养条件， 原种保存时间长短、培养基的成分不同而有差异，原种保存时间长短、培养基的成分不同而有差异， 一般为一般为10104 4-10-105 5细胞细胞/ml/ml。 4.2.3 细胞悬浮培养的方法细胞悬浮培养的方法 (2)(2)培养细胞的起始密度及细胞记数培养细胞的起始密度及细胞记数 细胞记数细胞记数 要保证细胞培养的最低有效密度，在细要保证细胞培养的最低有效密度，在细 胞游离后要对分离的单细胞进行记数，可用胞游离后要对分离的单细胞进行记数，可

9、用 血球记数板。血球记数板。 (2)(2)培养细胞的起始密度及细胞记数培养细胞的起始密度及细胞记数 活细胞测定活细胞测定 除测定细胞密度外，尚需要测定活细胞率除测定细胞密度外，尚需要测定活细胞率 以作为测定起始密度的参考。以作为测定起始密度的参考。 活细胞率（活细胞率（% %）= =（5 5个视野中的活细胞数个视野中的活细胞数/5/5 个视野中的细胞总数）个视野中的细胞总数）* *100%100% (2)(2)培养细胞的起始密度及细胞记数培养细胞的起始密度及细胞记数 a a、醋酸酯荧光素（、醋酸酯荧光素（fdafda）染色法）染色法 fdafda本身无荧光，无极性，可自由通过原生质本身无荧光，

10、无极性，可自由通过原生质 体膜进入细胞内部，进入后由于受到活细胞内脂酶体膜进入细胞内部，进入后由于受到活细胞内脂酶 分解，而产生有荧光的极性物质荧光素，不能自由分解，而产生有荧光的极性物质荧光素，不能自由 出入原生质体膜，在荧光显微镜下观察到荧光的是出入原生质体膜，在荧光显微镜下观察到荧光的是 有活力的，反之无活力。具体操作：有活力的，反之无活力。具体操作： 取取0.5ml0.5ml细胞悬浮液放入到小试管中，加入细胞悬浮液放入到小试管中，加入fdafda 溶液，使最后浓度达到溶液，使最后浓度达到0.01%0.01%，混匀，室温下作用，混匀，室温下作用 5min5min，荧光显微镜观察。，荧光显

11、微镜观察。 活细胞测定的方法活细胞测定的方法 b b、酚藏红花染色法、酚藏红花染色法 先配制先配制0.1%0.1%酚藏红花溶液，溶剂为培养液。检酚藏红花溶液，溶剂为培养液。检 查时将悬浮细胞取一滴放在载玻片上，滴一滴查时将悬浮细胞取一滴放在载玻片上，滴一滴0.1%0.1% 酚藏红花，盖上盖玻片，染成红色的是死细胞，无酚藏红花，盖上盖玻片，染成红色的是死细胞，无 色的是活细胞。色的是活细胞。 （3 3）悬浮培养细胞数目的增殖变化）悬浮培养细胞数目的增殖变化 细胞生长各个时期的特点细胞生长各个时期的特点 滞后期（延迟期）滞后期（延迟期） 细胞很少分裂，其长短与接种细胞很少分裂，其长短与接种 量大小

12、和继代时原种细胞所处的生量大小和继代时原种细胞所处的生 长期有关。长期有关。 对数生长期对数生长期 细胞分裂活跃，细胞数目增加，增细胞分裂活跃，细胞数目增加，增 长速率保持不变。长速率保持不变。 直线生长期直线生长期 细胞增值、生长和发育最明显的时期。细胞增值、生长和发育最明显的时期。 缓缓 慢慢 期期 生长逐渐缓慢生长逐渐缓慢, ,培养液消耗将尽，有培养液消耗将尽，有 毒代谢物质增多，氧气减少。毒代谢物质增多，氧气减少。 静静 止止 期期 生长几乎处于停止状态，细胞数目生长几乎处于停止状态，细胞数目 增加极少，甚至开始死亡。增加极少，甚至开始死亡。 a a、滞后期的长短主要取决于在继代时原种

13、培养细胞所处、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处 的生长期和转入细胞数量的多少。的生长期和转入细胞数量的多少。 b b、加入条件培养基可以缩短滞后期。、加入条件培养基可以缩短滞后期。 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。 c c、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直 保持对数生长期。保持对数生长期。 d d、如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会、如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会 引起细胞的大量死亡和解体。引起细胞的大量死亡和解体。 讨论讨论

14、对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小， 只能通过单细胞或小细胞团（只能通过单细胞或小细胞团（2- 42- 4细胞），使用细胞），使用 吸管或注射器。吸管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉 降，再吸上层悬浮液。降，再吸上层悬浮液。 依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。 操作注意事项操作注意事项 对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进行动态的测对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进行动态的测 定，以掌握其生长的基本规律，为继代培养或其他研究提定，以掌握其生长的基本

15、规律，为继代培养或其他研究提 供依据。供依据。 a a、细胞记数：、细胞记数： 注意：由于悬浮培养的细胞并不会呈游离单细胞，因注意：由于悬浮培养的细胞并不会呈游离单细胞，因 此此 通过培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞记数。可通过培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞记数。可 用用5%-8%5%-8%铬酸或铬酸或0.25%0.25%的果胶酶对细胞团进行处理。生长速的果胶酶对细胞团进行处理。生长速 率率p p p= p=（lnx-lnxlnx-lnx0 0）/t/t x x为为t t时间的细胞密度，时间的细胞密度，x0x0为起始细胞密度为起始细胞密度 （4 4）细胞生长的测定）细胞生长的测定 b b

16、、细胞大小的测定：显微测微计技术；、细胞大小的测定：显微测微计技术； c c、细胞体积：将一定量的细胞悬浮液放入放入、细胞体积：将一定量的细胞悬浮液放入放入15ml15ml刻刻 度离心管中于度离心管中于2000g2000g离心离心5min5min。以每毫升培养液中细胞。以每毫升培养液中细胞 体积的毫升数来表示。体积的毫升数来表示。 d d、细胞的干重和鲜重的测定：将一定量的细胞悬浮液、细胞的干重和鲜重的测定：将一定量的细胞悬浮液 加到预先称重的尼龙布上，用水冲洗并抽滤除去细胞加到预先称重的尼龙布上，用水冲洗并抽滤除去细胞 粘着的多余水滴，然后称重，两者差就是细胞的鲜重。粘着的多余水滴，然后称重

17、，两者差就是细胞的鲜重。 干重一般是将离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸干重一般是将离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸 片上，然后在片上，然后在6060烘烘12h12h，在干燥器中冷却后称重。细，在干燥器中冷却后称重。细 胞的干重和鲜重一般以每毫升悬浮培养物的重量表示。胞的干重和鲜重一般以每毫升悬浮培养物的重量表示。 e e、有丝分裂指数、有丝分裂指数 在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占 总细胞的百分数称为有丝分裂指数，指数越高，总细胞的百分数称为有丝分裂指数，指数越高， 分裂进行的速度越快。分裂进行的速度越快。 一般用孚尔根染色法，先将组织用一般用孚

18、尔根染色法，先将组织用1molhcl1molhcl 在在6060水解后染色，常规镜检，统计水解后染色，常规镜检，统计500500个细胞，个细胞， 计算。计算。 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在 30305050个细胞以下，在实际培养中很少有完全个细胞以下，在实际培养中很少有完全 由单细胞组成的植物细胞悬浮系。由单细胞组成的植物细胞悬浮系。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。 悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈 透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。透亮，细胞

19、色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2 23 3天天 甚至更短时间便可增加一倍。甚至更短时间便可增加一倍。 （5 5）一个成功的悬浮细胞培养体系）一个成功的悬浮细胞培养体系 必须满足三个条件必须满足三个条件 起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生 能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄 色，呈细小颗粒状，疏松易碎。色，呈细小颗粒状，疏松易碎。 接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往 使延迟期加长，悬浮细

20、胞的起始密度一般在使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在 0.50.52.52.510105 5个细胞个细胞/ /毫升，低于这一密度则会毫升，低于这一密度则会 使细胞生长延迟。使细胞生长延迟。 培养条件：方式、温度、继代周期。培养条件：方式、温度、继代周期。 （6 6）影响悬浮细胞生长的因素）影响悬浮细胞生长的因素 细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的 分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，分裂、代谢

21、以及生理、生化状态等更趋复杂化， 所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一 培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生 理学状态，工作中常用的处理方法：理学状态，工作中常用的处理方法： 5.2.4 悬浮细胞的同步化悬浮细胞的同步化 （1 1）物理方法）物理方法 分选法分选法 通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的 细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同 一培养体系中。一培养体系中。 5.2.4 悬浮细胞的同步化

22、悬浮细胞的同步化 fujimurafujimura分离胡萝卜悬浮液分离胡萝卜悬浮液 悬浮液悬浮液47m47m膜过滤膜过滤滤液滤液31m31m膜过滤膜过滤 收集收集网上细胞网上细胞加入等体积的培养基加入等体积的培养基 加入到加入到10%-18%10%-18%的的ficollficoll180g180g离心离心5min5min 收集各细胞层的细胞收集各细胞层的细胞 用培养基洗涤用培养基洗涤分别接种分别接种 （2 2）抑制剂法）抑制剂法 通过一些通过一些dna dna 合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在 dnadna合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞合成前期，

23、当解除抑制后，即可获得处于同一细胞 周期的细胞。周期的细胞。 常用的抑制剂有常用的抑制剂有5-5-氟脱氧尿苷，氟脱氧尿苷，5-5-氨基尿嘧啶、羟氨基尿嘧啶、羟 基尿等。基尿等。 （3 3）有丝分裂阻抑）有丝分裂阻抑 用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般 控制在控制在0.2%0.2%，处理时间以，处理时间以4-64-6小时为宜。小时为宜。 4.2.4 悬浮细胞的同步化悬浮细胞的同步化 （4 4）饥饿法）饥饿法 悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需 的营养成分或激素，使细胞停滞在的营养成分或激素

24、，使细胞停滞在g1g1或或g2g2期，经过一段期，经过一段 时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子 时，静止细胞就会同步进入分裂。时，静止细胞就会同步进入分裂。 （5 5）冷处理法。低温处理可以提高培养体系中细胞同）冷处理法。低温处理可以提高培养体系中细胞同 步化的程度步化的程度 4.2.4 悬浮细胞的同步化悬浮细胞的同步化 无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或 多或少都有一定的伤害。如果处理的细胞没有多或少都有一定的伤害。如果处理的细胞没有 足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效足够的生活力，不仅

25、不能获得理想的同步化效 果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行 同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培 养。用于处理的细胞系最好处于对数生长期。养。用于处理的细胞系最好处于对数生长期。 4.2.4 悬浮细胞的同步化悬浮细胞的同步化 4.3 单细胞培养技术单细胞培养技术 （1 1）建立单细胞无性系）建立单细胞无性系 悬浮培养细胞间细胞间在遗传、生理和生化上存悬浮培养细胞间细胞间在遗传、生理和生化上存 在差异，这些差异反映在它们的产量、品质、抗病虫在差异，这些差异反映在它们的产量、品质、抗病虫 性和抗逆性等方面。如

26、果能将高抗、高产、高品质的性和抗逆性等方面。如果能将高抗、高产、高品质的 细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经济效益。细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经济效益。 （2 2）排除体细胞的干扰）排除体细胞的干扰 （3 3）利于对细胞活动跟踪观察）利于对细胞活动跟踪观察 4.3.1 植物单细胞培养的意义植物单细胞培养的意义 (1)(1)细胞平板培养细胞平板培养 概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定 的细胞密度，接种在的细胞密度，接种在1mm1mm左右的薄层固体培养基上左右的薄层固体培养基上 进行培养，称之为平板培养。进行培养，称之为平板培养。 主要技术要点：主要

27、技术要点： 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞 团不能超过团不能超过6 6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选 择合适。择合适。 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养 基洗涤基洗涤2 2次以后，调整密度为次以后，调整密度为5 510105 5/ml/ml。 4.3.2 单细胞培养的方法单细胞培养的方法 植板：将植板：将1 1份已调整好密度的单细胞悬浮液与份已调整好密度的单细胞悬浮液与 4 4份份3535的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的 平铺于培养

28、皿中，其厚度为平铺于培养皿中，其厚度为1-2mm1-2mm。 待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或 parafilm封口膜将培养皿封严以防污染，在封口膜将培养皿封严以防污染，在2525黑黑 暗条件下培养暗条件下培养3 3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。周即可长出肉眼可见的愈伤组织。 植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞在接种单植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞在接种单 细胞中所占的比例来表示。细胞中所占的比例来表示。 植板率植板率( () )( (形成的细胞团数形成的细胞团数/ /接种的细胞数接种的细胞数) )100100 计算式中每个平板新形成的细胞团数的

29、计数方法有计算式中每个平板新形成的细胞团数的计数方法有 两种：一是直接计数法，注意计量时要掌握合适的时间，两种：一是直接计数法，注意计量时要掌握合适的时间， 即细胞团肉眼已能分辨，但尚未长合到一起的时候。二即细胞团肉眼已能分辨，但尚未长合到一起的时候。二 是感光法，在暗室的红光下将一印相纸放于欲计数的培是感光法，在暗室的红光下将一印相纸放于欲计数的培 养皿下，其上放一光源使培养皿中细胞团印到相纸上，养皿下，其上放一光源使培养皿中细胞团印到相纸上， 冲洗照片计数。冲洗照片计数。 （2 2）看护培养）看护培养 概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单 细胞使

30、其生长增殖的一种单细胞培养方法。细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。 4.3.2 单细胞培养的方法单细胞培养的方法 （3 3）微室培养）微室培养 概念：人工制造一个小室，将单细胞培养概念：人工制造一个小室，将单细胞培养 在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成 细胞团的方法，称微室培养。细胞团的方法，称微室培养。 4.3.2 单细胞培养的方法单细胞培养的方法 特点：特点： （1 1）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细 胞团的全过程；胞团的全过程； （2 2）培养基少，营养和水分难以保持，）培养基少，营养和水分难以

31、保持，phph值变值变 动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。 （4 4）其它单细胞培养技术）其它单细胞培养技术 a a 饲养层培养基技术饲养层培养基技术 将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细 胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养 细胞起到一个饲养作用。细胞起到一个饲养作用。 b b 双层滤纸植板培养方法双层滤纸植板培养方法 培养基培养基 饲养层细胞饲养层细胞看护滤纸层看护滤纸层 转移碟滤纸转移碟滤纸 培养细胞培养细胞 4.3.2 单细胞培养的方法单细胞培养的方法 4.4.

32、1 概述概述 4.4.2 培养系统培养系统 4.4.3 植物细胞规模培养技术要点技术要点植物细胞规模培养技术要点技术要点 4.4.4 提高细胞次生代谢产物的途径提高细胞次生代谢产物的途径 4.4.5 细胞规模化培养中的有关技术问题细胞规模化培养中的有关技术问题 n 4.4 植物细胞大规模培养植物细胞大规模培养 与次生代谢产物生产与次生代谢产物生产 4.4.1 概述概述 植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物次生代谢产物是指植物中一大类并非 植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其 产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育产生和分布通常有种属、器官组织和

33、生长发育 期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解 过程称为次生代谢。过程称为次生代谢。 （1 1） 植物产生代谢产物的类型植物产生代谢产物的类型 植物次生产物种类繁多（据保守估计已植物次生产物种类繁多（据保守估计已 超过超过2 2万种），根据分子结构不同大致分为：万种），根据分子结构不同大致分为： 酚类化合物黄酮类酚类化合物黄酮类 单酚类单酚类 醌醌 类（苯醌、萘醌、蒽醌）类（苯醌、萘醌、蒽醌） 萜类化合物三萜皂甙萜类化合物三萜皂甙 甾体皂甙甾体皂甙 单萜、倍半萜、二萜单萜、倍半萜、二萜 含氮化合物生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱）含氮化合物生物碱

34、（真生物碱、伪生物碱、原生物碱） 胺类（伯、仲、叔、季胺）胺类（伯、仲、叔、季胺） 非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸 生氰甙生氰甙 多炔类、有机酸等多炔类、有机酸等 （2 2）植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等）植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等 领域具有重要意义。领域具有重要意义。 李时珍（李时珍（15931593）在）在本草纲目本草纲目中所开列的中所开列的18921892 种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约2525的法定的法定 药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。 许多植物次生代谢产物是优良的

35、食品添加剂和名许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名 贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用 于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保 产品。产品。 4.4.1 概述概述 （3 3）规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径）规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径 保护生态环境保护生态环境 提高生产效率提高生产效率 发展新型生物技术产业发展新型生物技术产业 4.4.1 概述概述 植物细胞大规模培养的技术要求：植物细胞大规模培养的技术要求： 从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于

36、从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于 植物细胞生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制植物细胞生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制 和调节系统；和调节系统； 从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：培养从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：培养 的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物；的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物； 细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得 到较高产量的终产物；代谢产物要在细胞中积累而不到较高产量的终产物；代谢产物要在细胞中积累而不 被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。被迅速分解，最好能将其释放

37、到培养基中。 4.4.1 概述概述 4.4.2 培养系统培养系统 a a 悬浮培养系统悬浮培养系统 液体悬浮培养系统基本原理与上述实验室悬浮液体悬浮培养系统基本原理与上述实验室悬浮 培养方法一致，但大规模培养所采用的设备及控制培养方法一致，但大规模培养所采用的设备及控制 技术比实验室小规模培养要复杂的多。技术比实验室小规模培养要复杂的多。 机械搅拌式培养系统机械搅拌式培养系统 机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基 础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在 微生物发酵罐的基础上作如下改进：

38、搅拌装置要减少剪微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪 切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长， 需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由 于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可 能产生有害气体，所以必须设计通气装置；能产生有害气体，所以必须设计通气装置； 为便于取为便于取 样观察，一般还设计有取样口。样观察，一般还设计有取样口。 a a 悬浮培养系统悬浮培养系统 机械搅拌式培养系统机械搅拌式培养系统 a a 悬

39、浮培养系统悬浮培养系统 气压搅拌式培养系统气压搅拌式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免， 同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的 部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其 缺点是搅拌不均匀。缺点是搅拌不均匀。 旋转式培养系统旋转式培养系统 一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获 得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活， 缺点是培养体积较小。缺点是培

40、养体积较小。 旋旋 转转 式式 培培 养养 系系 统统 这一技术的优点在于：这一技术的优点在于： 可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特 定的代谢途径，并便于调节；定的代谢途径，并便于调节； 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的 状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次 生产物的合成；生产物的合成； 由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从 培

41、养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对 细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基 可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所 付出的时间和费用；付出的时间和费用； b b 固定化培养系统固定化培养系统 正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培 养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。 细胞固定化培养技

42、术按照其支持物不同可以分为细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为 两大类：两大类： 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼 脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等； 附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚 氨酯泡沫、中空纤维等材料。氨酯泡沫、中空纤维等材料。 4.4.3 植物细胞规模培养技术要点植物细胞规模培养技术要点 （1 1）细胞系的建立和选择）细胞系的建立和选择 有效成分分析有效成分分析 悬浮细胞系悬浮细胞系 单细胞培养与筛选单细胞培养与筛选 细胞增殖细胞增殖 （2 2）优良细

43、胞系的增殖培养）优良细胞系的增殖培养 所选择的优良细胞系，进行大规模繁殖，所选择的优良细胞系，进行大规模繁殖， 得到足够的细胞是建立细胞规模化培养体系得到足够的细胞是建立细胞规模化培养体系 的中间环节。的中间环节。 （3 3）大规模培养体系的建立）大规模培养体系的建立 一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同 步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。 两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定 时期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类时期进行，细

44、胞生长和产物合成需要不同的培养基的类 型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生 长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基 中培养。中培养。 如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采 用两步法建立体系。用两步法建立体系。 培养方式的选择：培养方式的选择： 间歇培养流加间歇培养间歇培养流加间歇培养 两级或多级间歇培养两级或多级间歇培养 连续培养单级连续培养连续培养单级连续培养 多级连续培养多级连续培养 回流式连续培养回流式连续培养 固定化细

45、胞培养固定化细胞培养 4.4.4 提高细胞次生代谢产物的途径提高细胞次生代谢产物的途径 （1 1）明确植物细胞生长与产物合成的关系）明确植物细胞生长与产物合成的关系 生长偶联型生长偶联型 产物合成与细胞生长成正比。如长春花产物合成与细胞生长成正比。如长春花 属植物中的长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成、薯蓣属植物中的长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成、薯蓣 属植物中的薯蓣皂甙的合成等；属植物中的薯蓣皂甙的合成等； 中间型中间型 产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指 数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类物质合成的植数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类物

46、质合成的植 物细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型；物细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型； 非生长偶联型非生长偶联型 产物合成在细胞生长停止以后。如紫产物合成在细胞生长停止以后。如紫 草宁的合成。草宁的合成。 （2 2）选择适宜的起始材料）选择适宜的起始材料 首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种 类。再此前提下，起始培养材料还应考虑器官和组类。再此前提下，起始培养材料还应考虑器官和组 织特异性，通常选取自然状态下能够积累次生产物织特异性，通常选取自然状态下能够积累次生产物 的部位，这样的细胞经过培养后常具有合成目的产的部位，这样

47、的细胞经过培养后常具有合成目的产 物的能力，或比较容易诱导合成目的产物。同时要物的能力，或比较容易诱导合成目的产物。同时要 筛选高产、稳产的细胞株系。筛选高产、稳产的细胞株系。 （3 3）选择合适的培养基成分）选择合适的培养基成分 一般来说，增加培养基的一般来说，增加培养基的n n，p p、k k的浓度能促的浓度能促 进细胞生长，而适当增加糖浓度有利于次生产物的进细胞生长，而适当增加糖浓度有利于次生产物的 合成。培养基的成分包括培养条件要通过一定的实合成。培养基的成分包括培养条件要通过一定的实 验才能选择出既有利于细胞大量生长繁殖又有利于验才能选择出既有利于细胞大量生长繁殖又有利于 次生代谢产

48、物大量产生的培养基。次生代谢产物大量产生的培养基。 （4 4）外因）外因 温度温度 phph 营养状况营养状况 通气状况通气状况 （5 5）激发子的应用）激发子的应用 植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通 常还与诱导因子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的常还与诱导因子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的 情况下，细胞次生代谢活动显著增强。因此，人为合理的情况下，细胞次生代谢活动显著增强。因此，人为合理的 应用这些诱导因子，就有可能提高目的产物的产量。应用这些诱导因子，就有可能提高目的产物的产量。 激发子也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中

49、一个反激发子也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中一个反 应，并形成细胞特征性自身防御反应的分子。应，并形成细胞特征性自身防御反应的分子。 a a、非生物激发子，如辐射、金属离子等、非生物激发子，如辐射、金属离子等 b b、生物激发子，（外源激发子，多来源于微生物，内源激、生物激发子，（外源激发子，多来源于微生物，内源激 发子，来源于植物本身的物质，如降解细胞壁的酶类，细发子，来源于植物本身的物质，如降解细胞壁的酶类，细 胞碎片、寡聚糖等。胞碎片、寡聚糖等。 （6 6）培养技术的选择）培养技术的选择 包括对反应器的选择和对培养方式的选择，就目前的技术包括对反应器的选择和对培养方式的选择，就目前的技

50、术 基础来讲，固定化培养是植物细胞规模化生产较为理想的系统。基础来讲，固定化培养是植物细胞规模化生产较为理想的系统。 为了同时满足细胞生长和产物合成的需要，通常需要在不同阶为了同时满足细胞生长和产物合成的需要，通常需要在不同阶 段使用不同的培养基，即两阶段培养段使用不同的培养基，即两阶段培养 为了解决产物对合成的反馈抑制可以采用两相培养技术，为了解决产物对合成的反馈抑制可以采用两相培养技术， 液液- -液系统：分离相常用的有液体石蜡、烷类化合物、甘油等液系统：分离相常用的有液体石蜡、烷类化合物、甘油等 液液- -固系统：常用的有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝、树脂固系统：常用的有活性炭、硅酸镁

51、载体、沸石、蚕丝、树脂 等。等。 一般来说，提取相的选择目标是具有较大的分离能力，同一般来说，提取相的选择目标是具有较大的分离能力，同 时对于没有毒副作用，不影响产物的化学稳定性。时对于没有毒副作用，不影响产物的化学稳定性。 4.4.5 细胞规模化培养中的有关技术问题细胞规模化培养中的有关技术问题 （1 1）悬浮培养系统必须适应植物细胞特性）悬浮培养系统必须适应植物细胞特性 （2 2）植物细胞培养液的流变特性）植物细胞培养液的流变特性 植物细胞培养液的流变特性常用粘度来描述植物细胞培养液的流变特性常用粘度来描述 培养过程中培养液的粘度变化可由细胞密度和细胞分泌培养过程中培养液的粘度变化可由细胞

52、密度和细胞分泌 物以及细胞状态引起。物以及细胞状态引起。 如烟草培养液的表观粘度培养过程中如烟草培养液的表观粘度培养过程中 主要是由培养细胞密度的增加引起的，当细胞密度低于主要是由培养细胞密度的增加引起的，当细胞密度低于7gl7gl-1 -1 时，培养液的粘度基本保持不变，而当细胞密度高于此值时，时，培养液的粘度基本保持不变，而当细胞密度高于此值时， 培养液的粘度即增加。培养液的粘度即增加。 长春花细胞培养，当细胞密度在长春花细胞培养，当细胞密度在10 10 glgl-1 -1时，培养液属于假塑性流体，此时，培养液的粘度依赖 时，培养液属于假塑性流体，此时，培养液的粘度依赖 于细胞年龄、形态和

53、细胞团的大小。于细胞年龄、形态和细胞团的大小。 在相同物质浓度下，大在相同物质浓度下，大 细胞团的营养液表观粘度明显大于小细胞团培养液的表观粘细胞团的营养液表观粘度明显大于小细胞团培养液的表观粘 度。度。 o o2 2： klakla（体积氧传递系数，单位时间、单位体积氧量）：如（体积氧传递系数，单位时间、单位体积氧量）：如 在在4l4l的气升式反应器中进行长春花细胞培养时，的气升式反应器中进行长春花细胞培养时，klakla在在 20h20h-1 -1左右时，细胞生长与次生产物合成均维持在良好 左右时，细胞生长与次生产物合成均维持在良好 状态；又如在状态；又如在15l15l的通风式反应器中培养的烟草细胞，的通风式反应器中培养的烟草细胞， 当当 klakla值在值在5 510h10h-1 -1的范围内，随着 的范围内，随着 klakla的增加，生物的增加，生物 量和代谢产物也呈线性增加。量和代谢产物也呈线性增加。 溶氧浓度：曾在不同氧浓度下对毛地黄细胞培养进行培养，溶氧浓度：曾在不同氧浓度下对毛地黄细胞培养进行培养， 结果显示，当培养基氧浓度从结果显示，当培养基氧浓度从10%10%饱和度上升至饱和度上升至30%30%时，时， 细胞的生长速率从细胞的生长速率从0.15d0.15d-1 -1上升至 上升至0.200.20-1 -1，如果溶氧浓度 ，