抗氧化测定方法(三种)

1、实验一 超氧阴离子自由基清除能力的测定抗氧化实验之一一 、目的要求通过本实验掌握利用利用植物（或微生物发酵生产的原料）提取物进行超氧阴离子自由基清除能力测定的方法。二、实验原理超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02，02能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在滞后30s45s与时间呈良好的线

2、性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有色产物在325nm有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02的浓度，清除02就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的。三、器材及试剂（一）器材恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等。10ml比色管、秒表、比色皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。（二）试剂邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(tris)、hcl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏血酸、bht等。（1）ph8.2的tris-hcl缓冲液（0.05mol/l，25）：50ml 0.1mol/l三羟甲基氨

3、基甲烷（tris）溶液与22.9ml 0.1mol/l 盐酸混匀后，加水稀释至100ml。（2）0.2mmol/l邻苯三酚溶液（邻苯三酚用0.05mol/l的盐酸配制 ）四、操作步骤（一）样品的测定（1）先将提取物用双蒸水配制成不同浓度梯度，在10ml的比色管中分别加入4ml（0.05mol/l）ph8.2的tris-hcl缓冲液，置于25水浴中预热20min，然后加入25水浴中预热20min不同浓度样品液1ml，再加入在25水浴中预热20min的0.2mmol/l邻苯三酚溶液1ml（邻苯三酚用0.05mol/l的盐酸配制 ），混匀后在25水浴中反应4min，立即用浓hcl两滴终止反应，并在3

4、25nm处测定吸光度（a样）。每管做三个重复，取平均值。.（2）同上述过程，只是用1ml的蒸馏水代替样品液，测定结果为原始管（a原）。每管做三个重复，取平均值。结果计算：a原 a样a原02清除率（%）= 100%注意：a样参比：缓冲溶液4ml+1ml样液+1mlhcl（0.05mol/l）代替邻苯三酚溶液a原参比：缓冲溶液4ml+1ml水代替样+1mlhcl（0.05mol/l）（二）阳性对照试验将抗坏血酸等抗氧化药品配制成梯度浓度，与提取样品一起进行抗氧化实验，进行结果对比，以判断样品的抗氧化能力。方法同样品的测定，只是将样品用抗氧剂代替即可。实验二 羟自由基清除能力的测定 抗氧化实验之二方

5、法一：羟自由基（oh）清除能力的测定邻二氮菲-fe2+ 氧化法一、目的要求 熟悉羟自由基清除能力测定的原理，掌握操作方法。二、实验原理羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，可以发生电子转移、夺取氢原子和羟基化等反应，可以使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类都发生氧化，并损伤膜结构及功能，在研究自由基时，反应可通过水的辐射、光解及化学反应来产生羟自由基，fenton反应是最常见的化学反应，fenton反应是以过氧化氢为氧化剂，以亚铁盐为催化体系的氧化反应方法。邻二氮菲-fe2+是一种氧化还原指示剂，其呈色变化可反映出溶液中氧化还原状态的改变。h2o2/fe2+体系，通过fenton反应所产生的羟自由

6、基（ho），邻二氮菲-fe2+水溶液可被羟自由基氧化为邻二氮菲-fe3+，从而使邻二氮菲-fe2+在536nm处的最大吸收峰消失，根据吸光度的变化，可推知系统中ho的产量。fenton反应是以过氧化氢为氧化剂，以亚铁盐为催化体系的氧化反应方法，其反应机理如下： fe2+ +h2o2fe3+ +oh+oh羟自由基可以与抗氧化剂发生作用，由于邻二氮菲fe2+水溶液显橙红色根据邻二氮菲fe2+颜色的变化可利用分光光度法（536nm处特征吸收峰的变化）对抗氧化剂的抗自由基性能进行分析。三、器材与试剂（一）器材恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗

7、仪等。试管、秒表、比色皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。（二）试剂邻二氮菲、h2o2、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、抗坏血酸、bht、乙醇等。（1）0.75mmol/l邻二氮菲溶液：取邻二氮菲（邻菲啰啉）1.487g，溶于100.00ml无水乙醇中，使用时用重蒸水稀释100倍。（2）0.2mol/l 的磷酸盐缓冲溶液（pbs液，ph7.4）：0.2mol/lna2hpo4 81ml0.2mol/lnah2po4 19mlnah2po42，分子质量156.03，0.2 mol /l溶液含31.21g/l。na2hpo412，分子质量358.22，0. 2 mol /l溶液含

8、71.64g/l。（3）0.75mmol/l硫酸亚铁溶液。（4）0.01%h2o2溶液。四、操作步骤（一）样品测定将提取物用双蒸水配制成不同浓度梯度，然后每一浓度均进行以下实验。（1）取0.75 mmol/l邻二氮菲溶液1ml于试管中，依次加入pbs液2ml和蒸馏水1ml，充分混匀后，加0.75 mmol/l硫酸亚铁溶液1ml，混匀，加0.01%h2o21ml，于37下温育60min，于536nm处测得其吸光度，其值为a损伤。其空白参比2ml pbs液+4ml水。（2）同（1），只有其中用1ml蒸馏水代替1ml h2o2，测得的吸光度称a未损伤。其空白参比为2ml pbs液+4ml水。（3）用

9、提取物试样液1ml代替（1）中的1ml蒸馏水，测得的吸光度称a样。其空白参比为1ml 试样液+2ml pbs液+3ml水。（二）阳性对照试验将抗坏血酸等抗氧化药品配制成梯度浓度，与提取样品一起进行抗氧化实验，进行结果对比，以判断样品的抗氧化能力。方法同样品的测定。（三）注意事项测定时加样方法对结果有重要影响，须先将邻二氮菲溶液、pbs液及双蒸水混均匀，每管加入硫酸亚铁溶液后立即混均匀，否则会使局部颜色过浓，溶液颜色不均匀，从而影响结果的稳定性。五、结果计算ho清除率（d）：d%=（a样a损伤）/（a未损伤a损伤 ）100%总的ho的产生量：a536=a未损伤a损伤加入样品后ho的产生量：a53

10、6=a未损伤a样实验三 还原力试验实验原理10：还原能力的测定是以样品是否是良好的电子供应者为指标的。如果样品是良好的电子供体，其供应的电子不仅可以使fe3+还原成fe2+，还可以与自由基结合形成惰性的物质，从而达到中断自氧化链锁反应的目的。操作过程11：在15ml的离心管中依次加入ph6.6的磷酸盐缓冲液2.5ml，不同浓度的样品液2.5ml和1%的铁氰化钾溶液2.5ml，混合均匀后，置于50水浴中温育20min，然后迅速冷却（冬季：自来水，夏季：冰水浴），再加入10%的三氯乙酸2.5ml，混匀后，在3000r/min的条件下离心分离10min后，取上清液5ml于20ml的比色管中，再加入蒸

11、馏水4ml和0.1 %的三氯化铁1ml，混匀后，放置10min，在700nm处测定吸光度，吸光值越高，还原力越强。参比（调零）：ph6.6的磷酸盐缓冲液2.5 ml +不同浓度的样品液2.5ml+10%的三氯乙酸2.5ml+2.5ml水清除超氧阴离子自由基的试验超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。本研究采用邻苯三酚自氧化法进行试验。. 实验原理6：邻苯三酚在碱性条件下

12、迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02，02能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在滞后30s45s与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有色产物在325nm有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02的浓度，清除02就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的。操作过程7：在10ml的比色管中分别加入4ml（0.05mol/l）ph8.2的tris-hcl缓冲液，置于25水浴中预热20min，然后加入样品液1ml，再加入在25水浴中预热20min的0.2mmol/l邻苯三酚溶液0.3ml（邻苯三酚用0.05mol/l的盐酸配制

13、），混匀后在25水浴中反应4min，立即用8mo1/l的hcl两滴终止反应，并在325nm处测定吸光度，同时用1ml的蒸馏水代替样品液作为空白管。每管做三个重复，取平均值。并且同时用10mmol/l的盐酸0.3ml代替邻苯三酚溶液0.3ml作试剂空白。（空白管、样品管都要做，都要将试剂空白去除）a空 a样a空02清除率（%）= 100%先配制成指定浓度（50mmol/l）的 tris-hcl 缓冲液，在加蒸馏水溶解时，首先加入小于计算所得的蒸馏水体积的蒸馏水，然后用 hcl 或者 naoh 调节 ph 至 8.2 ，最后再用蒸馏水定容到指定体积即可。tris-hcl缓冲液（0.05 mol/l

14、） 50毫升0.1mol/l三羟甲基氨基甲烷（tris）溶液与x毫升0.1mol/l盐酸混匀并稀释至100毫升。 ph (25) x (ml) 7.10 45.7 7.20 44.7 7.30 43.4 7.40 42.0 7.50 40.3 7.60 38.5 7.70 36.6 7.80 34.5 7.90 32.0 8.00 29.2 8.10 26.2 8.20 22.9 8.30 19.9 8.40 17.2 8.50 14.7 8.60 12.4 8.70 10.3 8.80 8.5 8.90 7.0 tris分子量121.14 ；0.1 mol/l溶液为12.114 g/l。tr

15、is溶液可从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严。50mmol/l ph8.2 tris-hcl 缓冲液的配制：准确称取6.057g tris样品，用蒸馏水定容于500ml容量瓶中，即为0.1mol/l tris溶液，取250 ml此tris溶液，再取114.5ml 0.01mol/l hcl溶液混合，调ph值至8.2并定容至500ml即可。3mmol/l邻苯三酚溶液的配制：准确称取0.3783g邻苯三酚，用0.01mol/l hcl溶液溶解定容至100ml，再取10ml此溶液定容至100ml即可。0.1mol/lhcl 的配制：浓盐酸10ml加水稀释至1l。2.2.3.1树脂的处理方法吸附

16、树脂生产过程中一般均采用工业级原料，产品没有经过进一步净化处理，因此，在使用树脂之前必须进行一定的处理，其预处理方法如下。将各种树脂先用95%乙醇浸泡24h，使树脂充分溶胀，然后用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊现象，再用去离子水洗尽乙醇，再用酸碱处理，首先用4倍体积5% hc1溶液，以5倍体积每小时的流速通过树脂层，并浸泡3h，然后再用去离子水以同样流速洗至洗出液ph值呈中性，再用4倍体积的5% naoh溶液，以5倍体积每小时的流速通过树脂层，并浸泡3h，然后用去离子水以同样流速洗至洗出液ph值中性，过滤，室温晾干，即完成对树脂的预处理和再生。装柱：用95%乙醇湿法装柱，继续用乙醇在柱上流动

17、清洗至流出液与水混合（1：5）不呈白色为止，然后用蒸馏水洗至无醇味，备用。推荐方法多糖含量的测定方法（硫酸-苯酚法）5原理：苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。试剂：1 浓硫酸：分析纯，95.5% 2 80%苯酚：80g苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。 3 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） 4 标准葡聚糖（dextran,瑞典pharmacia）,或分析纯葡萄糖。 5 15%三氯乙酸（15%tca）：15gtca加85g水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

18、6 5%三氯乙酸（5%tca）：25gtca加475g水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 7 6mol/l 氢氧化钠：120g分析纯氢氧化钠溶于500ml水。 8 6mol/l 盐酸 操作：1制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖含量（g），纵坐标为光密度值，得标准曲线。 2样品含量测定： 吸取0.2 ml的样品液（含多糖约50g，否则要稀释至一定容量后再测定），以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20min以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。 注意：（1）此法简单、快速