核酸类药物课件

1、1 第十二章第十二章 核酸类药物核酸类药物 2 第一节第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产核酸类物质的分离提取及其发酵生产 一、一、RNA与与DNA的提取与制备的提取与制备 （一）（一）RNA的提取与制备的提取与制备 1、工业用、工业用RNA的提取的提取 （1）RNA及其工业来源及其工业来源从微生物中提取RNA是工 业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰 富的核酸资源，如酵母酵母、白地霉白地霉、多种抗菌素的菌丝菌丝 体体青霉素，制霉菌素等菌体。 通常在细菌中通常在细菌中RNA占占525，在酵母中占，在酵母中占2.7 15，在霉菌中占，在霉菌中占0.7%28。 3 在菌体内RNA含量

2、的变化受培养基组成影响，其中 关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收 率高，易于提取RNA。 很显然在许多酵母中，早期细胞中的早期细胞中的RNA含量高含量高， 其确切数值取决于碳、氮比例碳、氮比例和培养基组成等。 （2）高）高RNA含量酵母菌株的筛选含量酵母菌株的筛选可以从自然界筛选筛选 到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种诱变育种的方法 提高酵母菌的RNA含量。 4 稀碱法：稀碱法：是用氢氧化钠溶液（氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变），使细胞壁变 性性，使核酸从细胞内释放出来核酸从细胞内释放出来。需用酸中和pH7。然 后除去菌体除去菌体，将pH调至RNA的等电

3、点等电点（pH2.5），使 RNA沉淀沉淀出来。上法的缺点是制得的RNAM r较 较 低低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90 保持保持 34h破坏酶破坏酶)。 浓盐法：浓盐法：是用高浓度盐溶液（高浓度盐溶液（6%8%）处理，同 时加热加热，以改变细胞壁的通透性改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内核酸从细胞内 释放出来。释放出来。 要避免分子降解分子降解，可采用苯酚法苯酚法制备RNA。用苯 酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水 溶液内含有全部全部RNA，可用乙醇沉淀乙醇沉淀出来。 5 脱氧核糖核蛋白脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液浓盐溶液1mol/L,不溶于

4、0.14mol/L,而核糖核蛋白核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。 （4）RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的 很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份 70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20以下缓 慢搅拌30分钟。用6molLHCl调至pH7，搅拌15 分钟，离心得清液255m1。冷至10以下，6mol LHCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNAl.8g （纯度80）。 6 （二）（二）DNA的提取与制备的提取与制备 1工业用工业用DNA的提取的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状， 加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌， 升温至100，保

5、温，保温15分钟，迅速冷却至分钟，迅速冷却至2025， 离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性含热变性DNA 的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解酶法降解 生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性 DNA溶液中逐渐加入等体积95乙醇乙醇，离心可获得纤 维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得 DNA粗品，产品含热变性含热变性DNA5060。 7 2、具有生物活性、具有生物活性DNA的制备的制备 动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水倍重量生理盐水 经组织捣碎机组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离心30分 钟，沉淀用同样体积的生理盐

6、水洗涤3次，每次洗后 离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣 碎3分钟，加入加入2倍量倍量5的（用的（用45%乙醇作溶剂）十乙醇作溶剂）十 二烷基磺酸钠二烷基磺酸钠，并搅拌23小时，在02500rpm离 心，在上层液中加入等体积的冷冷95乙醇乙醇，离心即可 得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温 干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5 十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠达110体积，搅拌搅拌1小时小时，经 5000rpm离心1小时，清液中加入加入NaCl达达1molL， 再缓慢加入冷冷95%乙醇乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗 涤，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性

7、（活性DNA制制 备需在备需在03操作）。操作）。 8 二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 （一）酶解法及碱水解法制备核苷酸（一）酶解法及碱水解法制备核苷酸 1、酶解法制备脱氧核苷酸、酶解法制备脱氧核苷酸 桔青霉桔青霉产生5-磷酸二脂酶磷酸二脂酶 红酵母红酵母产生3-磷酸二脂酶磷酸二脂酶 9 10 2、酶解法制备戊糖核苷酸酶解法制备戊糖核苷酸 我国从60年代开始使用核酸酶核酸酶P1降解核糖核酸生产 单核苷酸，日本年产呈味核苷酸呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸肌苷酸和鸟苷酸） 3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。 酶解法生产酶解法生产5单核苷酸工艺流

8、程单核苷酸工艺流程 11 12 3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（IG） 呈味核苷酸呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠肌苷酸钠和鸟苷酸钠， 商品名简称为（IG），用核酸酶核酸酶Pl降解RNA可获得 GMP和和AMP，其中AMP经脱氨脱氨生成IMP。双酶法生 产（I十G）工艺。 13 4菌体自溶法生产核苷酸菌体自溶法生产核苷酸 磷酸二酯酶磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA 可产生5-核苷酸核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法 生产5-核苷酸。 （1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程： 14 5碱水解法生产碱水解法生产2，3-混合核

9、苷酸混合核苷酸 RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定，结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定， 很容易生成很容易生成2，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更 不稳定，很易加水分解生成不稳定，很易加水分解生成2，3-混合核苷酸。混合核苷酸。 取RNA配成33.5%的水溶液，加氢氧化钠达 0.3molL浓度，升温至38，保温，保温1620小时小时，用 6molL盐酸中和至盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成水解成2，3- 核苷酸的降解率达核苷酸的降解率达95以上以上，将2，3-混合核苷酸混合核苷酸 制成每片含制成每片含50100mg的片剂的片剂，经临床使用，对非特

10、异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和 放疗后的升白血球均有较好疗效。 15 16 （二）发酵法生产核苷酸二）发酵法生产核苷酸 1发酵法生产肌苷酸（发酵法生产肌苷酸（IMP） 2、发酵生产黄苷酸（、发酵生产黄苷酸（XMP）及酶法转化成鸟苷酸）及酶法转化成鸟苷酸 17 （三）半合成法制备核苷酸（三）半合成法制备核苷酸 由于发酵法生产核苷发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸核苷悬浮于磷酸 三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷， 进行磷酸化，从核苷生成进行磷酸化，从核苷生成5-核苷酸收率可达核苷酸收率可达90%。 例一：肌苷例一：

11、肌苷2mmolL悬浮于悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温磷酸三乙酯中，温 度控制度控制0，添加氯化氧磷，添加氯化氧磷6mmolL，水，水2mmolL， 反应反应2h，5-IMP摩尔产率达摩尔产率达91。 例二：鸟苷例二：鸟苷2mmolL悬浮于悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温磷酸三甲酯中，温 度控制度控制0，添加氯化氧磷，添加氯化氧磷6mmolL，水，水2mmo/L， 反应反应6h，5-GMP摩尔产率达摩尔产率达90%。 18 三、核苷的制备三、核苷的制备 本节叙述核苷的化学法化学法和发酵法发酵法生产。 （）（）RNA化学水解法制备核苷化学水解法制备核苷 1核苷生产工艺流程核苷生产工艺流程 RNA经甲酰胺

12、化学水解制备核苷经甲酰胺化学水解制备核苷 19 （）（）RNA化学水解法制备核苷化学水解法制备核苷 1核苷生产工艺流程（图核苷生产工艺流程（图148） 20 21 （二）发酵法生产核苷（二）发酵法生产核苷 发酵法生产核苷核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果， 产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种 核苷的菌株有着许多共同特点共同特点： 它们都使用磷酸单酯酶磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小 芽抱杆菌为诱变出发菌株； 它们都是通过使用物理或化学诱变物理或化学诱变方法选育出在遗传性 状上具有特定标记的诱变菌； 它们在发酵培养时必须提供限量的生长因素限量的生长因素，并且好氧， 在某一特

13、定的范围内累积大量核苷。 22 1发酵法生产肌苷发酵法生产肌苷 (枯草杆菌枯草杆菌) 2、发酵法生产鸟苷和黄苷、发酵法生产鸟苷和黄苷 (肌苷产生菌肌苷产生菌 ) 3、发酵法生产腺苷、发酵法生产腺苷 (产氨短杆菌产氨短杆菌 ) 第二节第二节 核酸类药物核酸类药物 核酸类药物核酸类药物可分两大类两大类。一类一类为具有天然结构天然结构的 核酸类物质核酸类物质，这些品种都是生物体合成生物体合成的原料，或 是蛋白质、脂肪、糖生物合成蛋白质、脂肪、糖生物合成、降解以及能量代谢降解以及能量代谢 的辅酶辅酶。缺乏这类物质会使生物体代谢造成障碍， 发生病态。提供这一类药物，有助于改善机体的物有助于改善机体的物

14、质代谢和能量平衡质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺 氧组织恢复正常生理机能。 23 第二类为自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类第二类为自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类 似物或聚合物似物或聚合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗 病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干扰素、产生干扰素、 免疫抑制免疫抑制的临床药物。 第二类核酸类药物第二类核酸类药物大部分由自然结构的核酸类物自然结构的核酸类物 质质进行半合成为结构改造物合成为结构改造物，近年来发展为化学化学-酶酶 合成法合成法。大大提高收率，降低成本。 24 一、叠氮胸苷（一、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT） （一）结

15、构与性质（一）结构与性质 AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病艾滋病的新药 。 AZT的药理作用是人体内经磷酸化磷酸化后生成了3-叠氮- 2-脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后者取代了正常的胸腺嘧取代了正常的胸腺嘧 啶核苷酸参与病毒啶核苷酸参与病毒DNA的合成，含有的合成，含有AZT成份的成份的 DNA不能继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的不能继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的。 （二）生产工艺（二）生产工艺 此合成路线的起始原料是胸苷原料是胸苷，目前主要是从 DNA水解法水解法制备，由于原料来源少，合成路线较复 杂，成本很高。 25 已见报道的胸苷合成方法还有两条途径：已见报道的胸苷合成方法还

16、有两条途径： 从2-脱氧胞苷或2-脱氧鸟苷或2-脱氧腺苷与胸胸 腺嘧啶腺嘧啶反应，经大肠杆菌产生的磷酸化酶磷酸化酶催化生成胸胸 苷苷。 从鸟苷（300mmolL）与胸腺嘧啶（300mmol L）反应，在欧文氏菌AJZ992所产生的嘌呤核苷磷嘌呤核苷磷 酸化酶酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶嘧啶核苷磷酸化酶的催化下生成5-甲基尿苷， 然后经化学法合成胸苷。 26 27 二、阿糖腺苷二、阿糖腺苷Adenine arabinoside （一）结构与性质（一）结构与性质 阿糖腺苷阿糖腺苷的化学名称为9-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤， 或称腺嘌呤阿拉伯糖苷腺嘌呤阿拉伯糖苷。 早在1960年就在实验室合成了阿糖腺苷，1

17、969年美 国用StreptomycesantibioticusNRRL3238菌株，1972 年日本用Streptomyceshebacecus4334菌株发酵法发酵法 分别制备了阿糖腺苷分别制备了阿糖腺苷。 1979年用从EColi中分离得到的尿嘧啶磷酸化酶尿嘧啶磷酸化酶 和嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶，以固相酶固相酶的方法将阿糖脲苷将阿糖脲苷 转化为阿糖腺苷转化为阿糖腺苷。 28 （二）生产工艺（二）生产工艺 1、酶、酶-化学合成法化学合成法 最新的阿糖腺苷阿糖腺苷的合成法是酶酶-化学合成法化学合成法：用用 尿苷尿苷为原料经氧氯化磷氧氯化磷和二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺反应，生成 氧桥化

18、合物氧桥化合物，在碱性水溶液中水解成阿糖尿苷，然后 利用阿糖尿苷中的阿拉伯糖阿拉伯糖经酶法酶法转化成阿糖腺苷阿糖腺苷。 经选育从阿糖尿苷酶法合成阿糖腺苷的优秀菌株是 产气肠杆菌产气肠杆菌（Enterbacteraerogens），这株菌能产生 尿苷磷酸化酶尿苷磷酸化酶（Upase）和嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶 （Pynpase），用这个菌株的休止细胞休止细胞作为酶源，从 阿糖尿苷和腺嘌呤能高效地合成阿糖腺苷，菌体也可 制成固定化细胞进行连续生产。 29 30 2、以、以5-AMP为原料的化学合成为原料的化学合成 （三）作用与用途（三）作用与用途 阿糖腺苷阿糖腺苷是近年来引人注目的广谱广谱

19、DNA病毒抑制病毒抑制 剂剂，对单纯疱疹疱疹、型，带状疱疹，巨细，牛痘型，带状疱疹，巨细，牛痘 等等DNA病毒，在体内外都有明显抑制作用病毒，在体内外都有明显抑制作用。目前认 为，阿糖腺苷是治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。 阿糖腺苷在体内受激酶作用生成的阿糖腺三磷，阿糖腺三磷， 是脱氧腺三磷（是脱氧腺三磷（dATP）的拮抗物）的拮抗物，从而阻抑了以从而阻抑了以 dATP为底物的病毒为底物的病毒DNA聚合酶的活力聚合酶的活力。而且阿糖腺 三磷对于病毒DNA聚合酶的亲和性比宿主细胞的同 一个酶的亲和性高。因此这个药物对于抑制病毒具有 较高选择性。 31 三、三氮唑核苷三、三氮唑核苷 （一）结构与

20、性质（一）结构与性质 三氮唑核苷商品名病毒唑病毒唑，对DNA病毒，RNA病 毒都有广泛作用。本品为白色结晶，熔点174176， 易溶于水。 这个化合物经X线解析线解析，它的立体结构与腺苷、 鸟苷非常类似，在体内被磷酸化成三氮唑核苷酸在体内被磷酸化成三氮唑核苷酸， 抑制肌苷酸脱氢酶阻断鸟苷酸的生物合成阻断鸟苷酸的生物合成，从而抑制 病毒DNA合成。它的另一特点是对病毒作用点多， 不易使病毒产生抗药性。 32 （二）生产工艺（二）生产工艺 酶合成法酶合成法 使用产气肠杆菌产气肠杆菌，以（尿苷尿苷）肌苷和肌苷和 TCA为底物可以用酶法简易地合成三氮唑核苷 33 采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前

21、段使用 嘧啶核苷磷酸化酶嘧啶核苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶。 34 四、阿糖胞苷（四、阿糖胞苷（Cytarabine，Cytosine arabinoside， Arabinosyl Cytosine，Aracytidine） （一）结构与性质（一）结构与性质 阿糖胞苷阿糖胞苷又称胞嘧啶阿拉伯糖苷胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的组成部分是 阿拉伯糖阿拉伯糖。白色或类自色结晶性粉末，无臭，易溶 于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。 35 阿糖胞苷进入体内转变为阿糖胞苷酸，抑制 DNA聚合酶，阻止胞二磷转变为脱氧胞二磷从而抑阻止胞二磷转变为脱氧胞二磷从而抑 制制DNA的合成的合成

22、，干扰DNA病毒繁殖和肿瘤细胞增殖。 只能注射只能注射。 36 （二）生产工艺（二）生产工艺 1以以5CMP为原料的合成法为原料的合成法 （1）工艺路线：）工艺路线： 37 38 2、工艺过程：、工艺过程： 水解水解：并加入处理好的6.5L氢氧化镧凝胶，总体 积为7.5L，升温至90，在不断搅拌下，于pH9下进 行水解。在不同的反应时间内，均匀取出2mL凝胶溶 液，离心分离，取上清液5至10l，pH9.2电泳分析， 检查水解程度。 氧桥化氧桥化：氧桥化后总OD光谱高峰位置移至264nm （pH2） 氨解氨解：使氧桥断裂3，5-乙酰基脱落。 成盐成盐：2盐酸-甲醇 2、以葡萄糖酸钙为原料的合成路

23、线、以葡萄糖酸钙为原料的合成路线 39 五、聚肌胞苷酸（聚肌胞）（五、聚肌胞苷酸（聚肌胞）（Poyinosinic， Polycytidylic Acid，Poly1：C） （一）结构与性质（一）结构与性质 1967年美国人Field发现聚肌胞聚肌胞是干扰素诱导物干扰素诱导物，而 且具有广谱抗病毒作用。本品是人工合成的干扰素人工合成的干扰素 诱导剂诱导剂，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股 多聚核苷酸。本品可溶于溶于0.85氯化钠氯化钠溶液。 （二）生产工艺（二）生产工艺 70年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺如下： 1、底物、底物5-核苷二磷酸吡啶盐的制备核苷二磷酸吡啶盐的制备 2、固

24、定化多核苷酸磷酸化酶的制备、固定化多核苷酸磷酸化酶的制备 40 （3）、固定化多核苷酸磷酸化酶多核苷酸磷酸化酶，将分离纯化的酶 液滴加入冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核 苷酸磷酸化。 3、PolyI：C制备 （1）底物预处理：CDP吡啶盐转成锂盐，吡啶盐转成锂盐，IDP转成转成 钠盐。钠盐。 （2）酶促反应：（每毫升反应液含molL数） IDP或CDP15；Tris150；MgC126； 41 EDTA1；聚合酶5单位，pH9.0，37，34小时。 用盐酸调盐酸调pH1.52.0，使PolyI（或PolyC）沉淀，立 即离心。此后在磷酸液冲液中溶解，等摩尔PolyI与 PolyC混合，生

25、成产品。 （三）作用与用途（三）作用与用途 本品具有抗病毒，抗肿瘤，增强淋巴细胞免疫功本品具有抗病毒，抗肿瘤，增强淋巴细胞免疫功 能和抑制核酸代谢等作用能和抑制核酸代谢等作用。本品注入人体诱导产生诱导产生 干扰素。干扰素。 临床已试用于肿瘤、血液病、病毒性肝炎及痘类毒 性感染等多种疾患。 42 六、胞二磷胆碱（六、胞二磷胆碱（CDP-胆碱）胆碱） （Citico line， CDPcholine，Cytidine diphosphocholine） （一）结构与性质（一）结构与性质 胞二磷胆碱其化学名称为胞嘧啶核苷-5-二磷酸 胆碱钠盐本品为白色无定形粉末，易吸湿易吸湿，易溶于易溶于 水，几不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂水，几不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂。1 水溶液pH2.53.5，注射液pH7.0。 43 （二）生产工艺（二）生产工艺 1、酶合成法、酶合成法 胞二磷胆碱由微生物菌体所提供的酶系催化胞苷酸胞苷酸和 磷酸胆碱磷酸胆碱而合成，国内使用啤酒生产中废弃的酵母废弃的酵母， 反应体系为： 磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲液（pH8.0）200molml， CMP 20molml，磷酰胆碱磷酰胆碱30molml， 葡萄糖1000molml，MgSO4.7H2O20m