通过共表达转铁蛋白和细胞周期蛋白D1改造CHO细胞株

1、研 究 报 告doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2012.05.012通 过 共 表 达 转 铁 蛋 白 和 细 胞 周 期 蛋 白 d1 改 造 cho 细 胞 株付 玲 ，赵 兴 卉 ，郭 俊 伟 ，于 婷 ，宋 小 红 ，侯 利 华 ，陈 薇军 事 医 学 科 学 院 生 物 工 程 研 究 所 ，病 原 微 生 物 生 物 安 全 国 家 重 点 实 验 室（2004dav00214），北 京 100071摘 要 目 的 ：对 现 有 的 cho-dg44 细 胞 株 进 行 改 造 ，得 到 在 无 血 清 培 养 基 中 更 具 生 长 优 势 的 cho

2、 宿 主 细 胞 株 。 方法 ：分 别 克 隆 转 铁 蛋 白 和 细 胞 周 期 蛋 白 d1 基 因 ，构 建 共 表 达 2 种 基 因 的 pires 质 粒 ，转 染 cho-dg44 细 胞 株 ，筛 选g418 抗 性 克 隆 。 结 果 与 结 论 ：得 到 3 株 g418 阳 性 克 隆 株 ，其 中 转 铁 蛋 白 和 细 胞 周 期 蛋 白 d1 表 达 水 平 最 高 的 s6 与cho-dg44 相 比 ，在 无 血 清 培 养 基 中 生 长 更 快 、密 度 更 高 。关 键 词 中 国 仓 鼠 卵 巢 细 胞 ；代 谢 工 程 ；转 铁 蛋 白 ；细 胞 周

3、 期 蛋 白 d1中 图 分 类 号 q813; q78 文 献 标 识 码 a 文 章 编 号 1009-0002（2012）05-0676-04construction ofoptimized cho celllinesbyoverexpression oftransferrin and cyclin d1fu ling, zhao xing-hui*, guo jun-wei, yu ting, song xiao-hong, hou li-hua, chen wei*state key laboratory of pathogens and biosecurity（2004dav002

4、14）, beijing institute of biotechnology, beijing 100071, china*co-corresponding authors, chen wei, e-mail: ; zhao xing-hui, e-mail: abstract objective: to optimize cho-dg44 cell line for better performance in serum-free culture. methods:transferrin and cyclin d1

5、 orfs were inserted into pires, then the construct was transfected into cho-dg44cells. the cells were treated with g418 at a final concentration of 800 g/ml for selection. results and coclusion: three cho-dg44 cell lines overexpressing transferrin and cyclin d1 were obtained. the growth rate of oneo

6、f these three cell lines, s6, was significantly greater than cho-dg44 during days 47 of suspension culture inserum-free medium. our study proved that overexpression of cyclin d1 and transferrin could confer cho-dg44with increased growth rate, and provided new candidate cho cell lines for biopharmace

7、utical production.key words chinese hamster ovary cell; metabolic engineering; transferrin; cyclin d1中 国 仓 鼠 卵 巢 细 胞（chinese hamster ovarycell，cho 细 胞）表 达 系 统 因 具 有 准 确 的 转 录 后 修 饰功 能 ，且 表 达 的 糖 基 化 蛋 白 药 物 在 分 子 结 构 、理 化 性质 和 生 物 学 功 能 方 面 最 接 近 天 然 分 子 ，而 成 为 生 产 诸 如 抗 体 等 大 分 子 蛋 白 质 药 物 的 首 选 表

8、达 系 统 。 然 而 ，在 工 业 规 模 化 培 养 过 程 中 ，cho 细 胞 常 遇 到 细 胞 生 长 缓 慢 、易 凋 亡 ，以 及 对 无 血 清 培 养 基 适 应 性 差 等 问 题 1。 为 了 刺 激 cho 细 胞 的 生 长 ，需 要 在 无 血 清 培 养 基 中 添 加 胰 岛 素 样 生 长 因 子（igf）和 转 铁 蛋 白 等 生 长 因 子 ，这 些 因 子 大 多 是 动 物 来 源 的 蛋 白 质 ， 不 仅 费 用 高 昂 ，而 且 还 有 被 病 毒 污 染 的 潜 在 可 能 。利 用 代 谢 工 程 方 法 在 cho 细 胞 株 中 高 表

9、 达 某 些 重 要 基 因 ，可 以 使 所 构 建 的 新 型 cho 细 胞 株 在 一 定 程 度 上 克 服 上 述 局 限 ，更 适 应 产 业 化 规 模 培 养 的要 求 2。 例 如 ，共 表 达 igf-1 和 bcl-2 的 cho 细 胞 株不 仅 对 恶 劣 培 养 环 境 诱 导 的 凋 亡 具 有 更 强 的 抵 抗 能力 ，还 可 以 通 过 自 分 泌 igf-1，降 低 对 培 养 基 中 添 加igf-1 的 依 赖 性3。 与 未 经 改 构 的 cho 细 胞 株 相 比 ，共 表 达 存 活 素 和 细 胞 周 期 蛋 白 d1 的 cho 细 胞

10、株 进入 s 期 的 比 例 增 加 56%94% ，早 期 凋 亡 减 少 33%43% ，且 可 以 在 无 血 清 培 养 基 中 达 到 更 高 的 生 长 密度4；而 人 工 构 建 的 自 表 达 转 铁 蛋 白 和 igf-1 的 cho细 胞 株 甚 至 能 在 无 蛋 白 培 养 基 中 持 续 高 速 生 长5。我 们 通 过 在 cho 细 胞 株 中 共 表 达 转 铁 蛋 白 和 细 胞 周 期 蛋 白 d1，构 建 了 在 无 血 清 培 养 基 中 具 有 生 长 优 势 的 cho 宿 主 细 胞 株 。1材 料 与 方 法收 稿 日 期 ：2012-02-06

11、基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金（81025018，30570951）作 者 简 介 ：付 玲（1961- ），女 ，高 级 实 验 师通 信 作 者 ：陈 薇 ，（e-mail）；赵 兴 卉 ，（e-mail）1.1 材 料cho-dg44 和 cho-s 细 胞 购 自 invitrogen 公 司 ；cho-k1 细 胞 、大 肠 杆 菌 dh5感 受 态 为 本 室 保 存 ；质 粒 pires 购 自 clontech 公 司 ；pgem-t 购 自 promega 公 司 。ht、细 胞 贴

12、 壁 培 养 所 用 的 mem 培 养 基 及 悬 浮培 养 所 用 的 cho-s-sfm培 养 基 购 自 invitrogen 公司 ；胎 牛 血 清（fbs）购 自 hyclone 公 司 ；细 胞 转 染 试剂 lipofectamine 2000 购 自 invitrogen 公 司 。转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 d1 的 抗 体 、ecl 免 疫 印 迹底 物 购 自 santa cruz 公 司 ；辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的二 抗 购 自 中 杉 金 桥 公 司 。1.2 双 顺 反 子 表 达 载 体 ptid 的 构 建根 据 genbank 序 列

13、bc092046 设 计 转 铁 蛋 白 基因 引 物 ，在 基 因 中 部 设 计 xho酶 切 位 点 ，分 成 2 部分 ，以 小 鼠 肝 脏 cdna 为 模 板 扩 增 ，通 过 nhe和 mlu克 隆 入 pires；依 照 文 献 6 方 法 ，以 cho-s 细 胞 系的 cdna 为 模 板 扩 增 周 期 蛋 白 d1 基 因 序 列 ，通 过bamh和 sal克 隆 入 pires。 引 物 见 表 1。pcr 扩 增 条 件 ：94预 变 性 10 min，然 后 从 54开 始 每 5 个 循 环 退 火 温 度 增 加 2直 至 62，每 个 循环 72 延 伸 9

14、0 s，最 后 延 伸 7 min。 产 物 进 行 琼 脂糖 凝 胶 电 泳 ，从 胶 上 切 下 各 约 1000 bp 的 片 段 ，连 接入 pgem-t 载 体 ，测 序 。将 测 序 正 确 的 转 铁 蛋 白 2 段 基 因 分 别 用 核 酸 内切 酶 nhe/xho和 xho/mlu从 经 测 序 正 确 的 t载 体 中 切 下 ，连 入 经 nhe/mlu酶 切 的 连 有 正 确 的周 期 蛋 白 d1 基 因 序 列 的 载 体 中 ，选 取 酶 切 鉴 定 正 确的 质 粒 ，命 名 为 ptid（图 1）。1.3 cho-dg44 细 胞 的 转 染 与 阳 性

15、克 隆 的 筛 选用 lipofectamine2000 将 ptid 转 染 cho-dg44细 胞 ，根 据 试 剂 说 明 书 操 作 。 以 终 浓 度 为 800 g/ml 的 g418 筛 选 阳 性 克 隆 。 铺 96 孔 板 ，挑 取 30 个g418 阳 性 克 隆 放 大 培 养 。1.4western 印 迹 验 证 转 铁 蛋 白/周 期 蛋 白 d1 基 因在 cho-dg44 细 胞 中 的 表 达细 胞 裂 解 物 的 提 取 方 法 及 western 印 迹 方 法 参照 文 献4。1.5 无 血 清 培 养 基 中 细 胞 生 长 曲 线 测 定cho-d

16、g44 及 表 达 转 铁 蛋 白/周 期 蛋 白 d1 的 阳性 克 隆 在 含 ht 的 无 血 清 培 养 基 cho-s-sfm中 培养 至 对 数 期 ，以 2000/孔 的 密 度 接 种 96 孔 板 ，每 孔 加入 200 l 上 述 无 血 清 培 养 基 。 每 天 每 株 细 胞 取 3孔 ，用 台 盼 蓝 染 色 ，计 数 活 细 胞 。2结 果2.1 转 铁 蛋 白/周 期 蛋 白 d1 基 因 的 克 隆由 于 以 cho-k1、cho-dg44 和 cho-s 等 3 株cho 细 胞 的 cdna 为 模 板 都 没 有 扩 增 到 转 铁 蛋 白 基因 ，于

17、是 便 以 小 鼠 肝 脏 cdna 为 模 板 扩 增 。 在 基 因中 部 设 计 引 物 ，引 入 酶 切 位 点 xho，分 成 2 段 分 别克 隆 ，pcr 结 果 如 图 2 所 示 。分 别 以 cho-k1、cho-dg44 和 cho-s 的 cdna 为 模 板 ，扩 增 中 国 仓 鼠 周 期 蛋 白 d1 基 因（图 3）。与 cho-dg44 一 样 ，cho-s 也 是 购 自 invitrogen 公司 的 商 品 化 细 胞 ，由 细 胞 株 cho-k1 驯 化 而 来 ，因 此是 dhfr 非 缺 陷 型 细 胞 ，可 在 无 血 清 培 养 基 cho-

18、s-sfm中 悬 浮 生 长 。 该 细 胞 株 与 cho-dg44 相 比虽 然 无 法 用 mtx 加 压 ，但 其 生 长 活 力 比 cho-dg44图 2 转 铁 蛋 白 基 因 的 扩 增m：dna marker dl2000；1：转 铁 蛋 白 基 因 前 半 段 ；2：转 铁 蛋 白 基 因 后 半 段图 1 表 达 载 体 ptid 示 意 图 表 1 引 物 序 列 引 物 序 列（5-3） 备 注 周 期 蛋 白 d1 基 因 上 游 引 物周 期 蛋 白 d1 基 因 下 游 引 物转 铁 蛋 白 基 因 前 段 上 游 引 物转 铁 蛋 白 基 因 前 段 下 游

19、引 物 转 铁 蛋 白 基 因 后 段 上 游 引 物ccd1-fccd1-rtf-fxho-rxho-ftaggatcccaccatggaacaccagctcctgaagtcgactcagatgtccacatctctagctagccaccatgaggctcaccgtgggtacacttggttctctcgaggtgtctctcgagagaaccaagtgt tf-r ataacgcgtttaatgtttgtggaaagtg 转 铁 蛋 白 基 因 后 段 下 游 引 物 高 ，代 时 也 比 cho-dg44 短 。 由 于 我 们 克 隆 的 是 与细 胞 周 期 相 关 的 周 期 蛋

20、白 d1 基 因 ，因 此 推 测 这 些 基因 在 cho-s 中 的 表 达 水 平 应 该 比 在 cho-dg44 中高 ，因 而 更 容 易 进 行 pcr 扩 增 。 所 得 基 因 序 列 已 以序 列 号 ef524275 在 genbank 中 注 册 。 中 国 仓 鼠 周期 蛋 白 d1 的 cdna 序 列 与 小 鼠 的 同 源 性 为 94.6 。2.2 转 铁 蛋 白/周 期 蛋 白 d1 在 g418 阳 性 细 胞 中 的表 达如 图 4 所 示 ，与 未 转 染 ptid 的 cho-dg44 相 比 ，3 个 阳 性 克 隆 株 中 转 铁 蛋 白 和 周

21、 期 蛋 白 d1 都 获 得 了 明 显 表 达 ，而 且 细 胞 株 s6 中 2 种 蛋 白 的 表 达 水 平 都 显 著 高 于 e5 和 e8。2.3 表 达 转 铁 蛋 白/周 期 蛋 白 d1 的 cho 细 胞 株 s6在 无 血 清 培 养 基 中 较 cho-dg44 更 具 生 长 优 势cho-dg44 是 适 于 在 无 血 清 培 养 基 cho-s-sfm 中 生 长 的 细 胞 株 ，因 此 我 们 检 测 了 cho-dg44 及 3 株 转 染 ptid 并 表 达 转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白d1 的 细 胞 株 在 这 种 无 血 清 培 养 基

22、 中 的 生 长 情 况 。如 图 5 所 示 ，e5 和 e8 在 培 养 的 第 27 d，其 细 胞 密 度都 与 cho-dg44 接 近 ；而 s6 在 培 养 的 前 3 d 细 胞 密度 与 cho-dg44 接 近 ，第 47 d 细 胞 密 度 都 显 著 高于 cho-dg44（p0.05）。优 势 的 cho 细 胞 株 。在 获 得 的 3 株 g418 筛 选 阳 性 的 细 胞 株 中 ，e5 和e8 在 无 血 清 培 养 基 中 的 生 长 速 率 与 培 养 第 7 d 达 到的 细 胞 密 度 都 与 cho-dg44 差 别 不 大 ，但 s6 则 明 显

23、较 cho-dg44 具 有 更 快 的 生 长 速 率 ，并 且 可 以 在 培养 第 7 d 达 到 更 高 的 细 胞 密 度 。 我 们 注 意 到 ，s6 中的 转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 d1 的 水 平 都 高 于 e5 和 e8，提 示 2 种 蛋 白 的 较 高 表 达 水 平 是 赋 予 细 胞 显 著 的 生长 优 势 所 必 需 的 。我 们 通 过 对 cho 细 胞 的 改 造 ，使 之 更 适 于 在 无 血 清 培 养 基 中 悬 浮 培 养 ，并 且 较 改 造 之 前 具 有 生 长优 势 。 因 此 ，当 我 们 将 改 造 后 的 cho 细 胞

24、 株 s6 应 用图 3 以 不 同 细 胞 cdna 为 模 板 扩 增 周 期 蛋 白 d1 基 因m：dna marker dl2000；1：以 cho-k1 细 胞 cdna 为 模 板 ；2：以 cho-dg44 细 胞 cdna 为 模 板 ；3：以 cho-s 细 胞 cdna 为 模 板讨 论3无 血 清 悬 浮 培 养 因 具 有 培 养 基 成 分 相 对 明 确 、产 品 下 游 处 理 工 序 简 单 、能 够 实 现 高 密 度 培 养 等 优 势 ，已 逐 步 取 代 贴 壁 培 养 成 为 cho 细 胞 表 达 系 统 的 工 业 化 应 用 趋 势 7。 转

25、铁 蛋 白 可 以 协 助 细 胞 利 用 三 价 铁 离 子 ，并 且 自 身 也 是 一 种 生 长 因 子 ，是 工 业 化 大 规 模 细 胞 培 养 所 应 用 的 无 血 清 培 养 基 的 重 要 添 加 成 分 。 本 研 究 构 建 载 体 所 采 用 的 转 铁 蛋 白 cdna 带 有 信 号 肽 序 列 ，因 此 可 被 细 胞 自 分 泌 到 培 养 基 中 ，从 而 减 少 培 养 基 中 转 铁 蛋 白 的 添 加 量 ，降 低 生 产 成 本 。 细 胞 周 期 蛋 白 d1 是 一 种 作 用 于 g1 期 细 胞 的 周 期 蛋 白 ，能 够 促 进 细 胞

26、 进 入 s 期 8。 在 我 们 的 前 期 研 究 中 发 现 ，周 期 蛋 白 d1 在 cho-dg44 细 胞 中 高 表 达 能 够 有 效 增 加 培 养 体 系 中 s 期 细 胞 的 百 分 比 ，促 进 细 胞 生 长 。 我 们 尝 试 在 cho-k1（dhfr+）、cho-s（dhfr+） 和 cho-dg44（dhfr-）等 3 种 常 见 cho 细 胞 株 中 克 隆 转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 d1 基 因 ，结 果 在 3 株 细 胞 中 都 未 能 成 功 克 隆 转 铁 蛋 白 基 因 ，而 仅 在 cho-s 中 克 隆 到 转 周 期 蛋 白

27、 d1 基 因 ；换 言 之 ，在 cho-dg44 中 转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 d1 基 因 都 没 有 得 到 成 功 克 隆 ，说明 它 们 在 cho-dg44 细 胞 中 的 表 达 水 平 很 低 。 因此 ，我 们 将 转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 d1 基 因 引 入cho-dg44 中 ，以 构 建 在 无 血 清 培 养 基 中 具 有 生 长图 4 western 印 迹 检 测 3 个 阳 性 株 中转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 d1 的 表 达 水 平图 5 cho-dg44 与 3 个 阳 性 克 隆 株 在 无 血 清 培 养 基 中 的

28、生 长 曲 线于 目 的 蛋 白 的 表 达 时 ，细 胞 将 更 易 于 培 养 ，并 对 培 养基 中 额 外 添 加 转 铁 蛋 白 成 分 的 依 赖 性 降 低 ，这 为 提 高 大 规 模 培 养 效 率 并 降 低 成 本 提 供 了 便 利 。4zhao x, guo j, yu y, et al. overexpression of survivin andcyclin d1 in cho cells confers apoptosis resistance and enhances growth in serum-free suspension culturej. biot

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