高分辨率熔解曲线分析技术用于乙醇脱氢酶1B和乙醛脱氢酶2基因的快速分型（可编辑）

1、高分辨率熔解曲线分析技术用于乙醇脱氢酶1b和乙醛脱氢酶2基因的快速分型 南方医科大学级硕士学位论文高分辨率熔解曲线分析技术用于乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因的快速分型 ?课题来源:十一五国家支撑计划课题.和国家高技术研究发展计划计划,.业 称专 名 医学遗传学学位申请人 袁晓文指 导 教 师 徐湘民教授周万军博士龚瑶琴教授答辩委员会主席邬玲仟教授答辩委员会成员王红艳教授袁慧军教授赵彦艳教授论文评阅人 白晓春教授孙筱放教授日年月 深圳高分辨率熔解曲线分析技术用于乙醇脱氢酶 和乙醛脱氢酶基因的快速分型硕士研究生:袁晓文导师:徐湘民教授摘要背景与目的乙醇脱氢酶,和乙醛脱氢酶,是在人体内乙醇代谢途径的两个

2、关键酶,负责催化人体的乙醇分解代谢,即催化乙醇向乙醛转化以及乙醛向乙酸盐分解的关键酶。的活性增强可以加速乙醇向乙醛转化,而活性的降低则使乙醛向乙酸盐转化受到限制,同样使乙醛的浓度显著增高。乙醛浓度的增加与酒精相关性疾病的发生发展有一定关系。和基因多态性具有种族特异性,在不同种族人群中分布是不一样的。据研究显示,亚洲人的酒精依赖性疾病主要与和基因变异密切相关。基因位于号染色体长臂区带,基因在第号外显子发生变异,形成,导致亚基的第位氨基酸从精氨酸转换为组氨酸从而形成艮,酶活性增高。基因位于号染色体长臂区带,基因在第号外显子发生变异,形成,与此同时,酶的第位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸。野生型具有活性,

3、突变型没有酶活性。和基因的变异会使酶代谢活性改变,导致饮酒在不同种族和个体间酒精代谢发生改变。这些年来,研究发现这两种变异与摘要各个组织器官的癌变,乙醇相关的肝脏病变、迟发型老人痴呆、冠心病、型糖尿病并发症、血液中胆固醇水平都有不同程度的联系。因此,一种准确快速的基因型分析方法对于有关的临床研究和人群普查等广阔研究领域是十分必要的。近年发展起来的高分辨率熔解曲线分析,技术已被证明是一种具有低成本、高通量、速度快、操作简便、高灵敏度等优点的用于基因突变检测、基因分型和检测的工具。不同核酸分子的片段长短、碱基组成、分布等是不同的,因此在加热变性后所有的双链分子都会有自己相应的熔解曲线形状和位置。当

4、扩增目的片段含有突变/时,目的产物经过变性.复性会产生异源双链,异源双链中突变/位点是不匹配的,所以双链在升温过程中先解链,此时荧光染料从局部解链的双链分子上释放出来,根据荧光强度与温度曲线图可以判断是否具有突变/,同时不同的位点和杂合度都会影响熔解曲线的峰形。分析过程中,随着双链分子的扩增,由于荧光染料结合到重新产生的双链分子,荧光信号不断的增强。当进入扩增平台期时,荧光信号同时也进入了平台期。随着温度的不断升高,双链逐渐解开,结合上的饱和染料被释放出来,荧光信号逐渐减弱。直到温度升到,所有的双链分子完全解开,通过检测荧光值,建立荧光值随温度升高的变化过程得到熔解曲线。技术的基本原理就是根据

5、熔解曲线的差异性来对样品进行区分。以往的变异检测技术,限制性内切酶片段长度多态性,单链构象多态性分析,两对交叉引物、 . ,扩增产物长度多态性,变性高效液相色谱等具有一定的局限性,如耗时长,操作繁琐,准确度低,成本相对较高等。与这些方法相比,分析方法具有一定的优势:成本低,只需饱和染料不需要昂贵的探针;在反应结束后,不需要后续工作而硕士学位论文直接进行熔解曲线反应;快速、高通量,一次可以同时检测或个样本;闭管操,防止样本遭受污染;经过分析处理后的扩增产物还可以直接进行测序,十分方便快捷。具有较高的敏感性和特异性,目前已广泛应用于生命科学、医学、农学、畜牧业等各个领域的研究工作中。基于上述特点,

6、本研究拟应用技术,建立和的检测方法,对预测个体患酒精相关疾病的风险和研究酶变异与酒精相关疾病的关系提供方便,同时为中国南方酒精相关疾病患者的遗传咨询、临床诊断提供有用的信息。材料与方法.标本:共收集例全血标本。采用标准的饱和酚/氯仿法提取外周血中的基因组。.分子分析方法:针对和基因以及和变异位点设计扩增体系及优化条件。通过测序获得和各种基因型样品。建立检测和基因的高分辨率熔解曲线分析技术。针对和基因以及和变异位点设计分析的引物,利用经测序已知的基因型样品优化分析条件,从而建立和基因的高分辨率熔解曲线分型的分析方法。根据的分析结果,从各种基因型中选取一定数量的样品进行测序分析,以验证评价该方法的

7、准确性。并且选取每种和基因野生纯合子和突变纯合子各个样本进行重复实验。同时对基因的野生纯合子和突变纯合子样本进行了倍稀释法,进行个浓度检测,探讨该方法检测敏感性。.统计学分析:对构建的和基因已知突变分型检测体系进行准确性和稳定性分析。利用部分样本直接测序对比来验证其准确性;采用重复性实验以确定该体系的稳定性与准确性。同时分析东莞地区随机汉族人群的摘要和的基因频率和基因型频率,并应用矛检验该群体样品是否符合?平衡。使用的统计学分析软件为.。.实验结果的综合分析、总结。结果建立了稳定可靠的双重检测体系。此体系中,所选取的扩增目的序列以及所设计的引物的特异性高。和基因的野生纯合子/,杂合子/,突变纯

8、合子/三种基因型能够在上进行明显的区分。用盲法分析对该方法进行评价,用此方法分析东莞地区份汉族人基因组样品,从每组基因型中随机选出部分样品进行测序对照,结果符合率为%,证实了该方法的准确性很好;进行重复实验,发现三次实验的变异系数的范围从.%到.%,证实了该方法的稳定性很好。在倍稀释试验中,个浓度均可以准确分型,可以知道.浓度仍然可以用于此检测体系。矿检验结果显示所选群体符合平衡,与基因频率与以前所报道的数据基本符合,从另一个方面说明了该方法的准确性。结论饮酒已被认为是危害人类健康的严重危险因素,容易导致多种酒精相关疾病。酒精在体内剂量效应和作用时间,不仅仅与酒量和饮酒频率相关,还与易感基因和

9、代谢能力有强关联性。和两种基因的变异与酒精依赖性疾病密切相关,所以枷和两种基因进行快速分型,在中国人群中进行快速筛查,不仅能够对酒精相关疾病风险进行评估,还有助于研究和基因与其他相关疾病的致病机理。高分辨率熔解曲线分析技术是近几年兴起一种基于核酸的物理性质的基因突变检测技术。这种检测技术没有局限于突变碱基位点与类型,不需使用序列特异性探针,在结束后直接进行高分辨率熔解曲线分析来完成对样品基因型的分析。因其操作简便、快速,成本低,结果准确,高通量,并且闭管硕士学位论文操作而备受关注。高分辨率熔解曲线分析技术只需要在普通基础上增加一个饱和染料既可以进行未知突变扫描,也可以对已知突变进行基因分型,还

10、可以分析短片段重复序列。分析的这些优势使它具有极强的可操作性,近年来成为国内外新兴的各研究领域学、方法学研究和应用热点。本课题研究中建立的针对和基因的高分辨率熔解曲线分析检测方法能够快速、准确地同时对和基因进行检测,并且实验的重复性和稳定性好、敏感性高、体系可靠。本研究对中国南方人群进行检测,发现所检测的人中不存在/和/组合的个体,所以推测这种基因型组合在中国南方是很少见的。有关文献报道,等位基因会增加食道癌,肝癌等癌症发生的风险性。同时很多的研究表明彳删?/叼或彳删.吲叼个体由于乙醛的积累导致其患有食道癌等癌症的风险更大,然而同时对这两个基因进行联合研究的很少,因此同时纳入和彳删两基因的病例

11、.对照研究是下一步进行疾病风险研究的重点工作。本研究为和基因的检测建立了一种简单、高通量、快速、经济和灵敏的检测方法,有助于酒精相关疾病的遗传学咨询,流行病学调查,并为研究和基因与其他相关疾病的关系提供了一项常规检测手段。本研究方法的一些处理技巧如改变扩增子长度以及加尾处理具有普遍的代表性与通用性,可为其它基因同时分型的检测方法研究提供借鉴与参考。关键词 乙醇脱氢酶:乙醛脱氢酶;高分辨率熔解曲线分析;基因分型硕士学位论文三 一 ?: .?:.。, ,. 一,. ,. 彳三旧. ., .晰 , ., , , , , .,.?.?, , . ,.,. :. ., 谢, . , . . , /, ,

12、、析,. , ,.晰 :、访 ;加硕士学位论文? ; ;, .曲. ,., ?.: , ./. 彳加. . . , ?/,?/., ,?/./. .,? . ,.?/叼? .?产 . . 娃; , . . % . . . % .%. / /?,., , , , .? . . . , 札.,.,硕士学位论文,. , ,. ,.,. ,. ,曲 .,/. . 彳聊 . 、 ./. . , . , , ,.: ; ;硕士学位论文目 录摘要.第一章 引言第二章实验材料.实验仪器及分析软件?.实验试剂:.:外周血基因组提取试剂.常规试剂。.电泳试剂?。.高分辨率熔解曲线分析试剂。.外周血样品及样品?.已

13、知基因型样品. .方法学评价所用基因型样品?第三章实验方法?.技术路线图?.样品基因组的提取及浓度测定.酚/氯仿法抽提基因组.基因组浓度测定:.高分辨率熔解曲线分析方法的建立和评价.高分辨率熔解曲线分析方法的建立。.双重高分辨率熔解曲线分析方法的评价.等位基因频率的计算和?平衡的判定?.结果分析?.统计学分析目录.高分辨率熔解曲线分析检测标本结果分析.第四章实验结果?.双重高分辨率熔解曲线分析方法检测和已知基因型的结果.双重高分辨率熔解曲线分析方法的评价。.双重高分辨率熔解曲线分析检测体系的灵敏度和准确性的评价.双重高分辨率熔解曲线分析体系的重复性和稳定性的评价.双重高分辨率熔解曲线分析体系的

14、敏感性评价?.各等位基因频率和.平衡的判定第五章分析与讨论?.第六章结论?.参考文献附 录.攻读硕士学位期间所发表论文?中英文缩略词表?致 谢。?。学位论文原创性声明统计学审稿证明?.硕士学位论文第一章引言年月日,参加人类基因组计划的国美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和中国科学家共同宣布,人类基因组草图的绘制工作已经完成。年月日,这国还公布了人类基因组精细的工作框架图及其初步的注解结果。整个人类基因组测序工作的完成,为人体生物学和医学研究开辟了一个新纪元,它不仅对生命本质、人类进化、生物遗传一群体差异、发病机理、疾病预防与治疗、新药开发等众多领域具有重要意义,并且对整个生物学发

15、展产生巨大的影响,标志着人类生命科学进入一个新时代。然而,仅依靠测定基因组序列来详细阐述人类基因编码序列及非编码序列的功能是远远不够的,此时还需要通过“后基因组研究去揭示。人类基因组计划的主要目标是解读人类基因组的序列,而后基因组计划是以了解基因组的功能及调控机制为目标,其核心科学问题主要包括:人类基因组的多样性计划,基因组的表达调控机制,蛋白质产物的功能,以及模式生物基因组功能研究等。单核苷酸多态性 ,主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的序列多态性。人类基因组序列已鉴定万,其中万多位于基因编码区,一些可以影响到个体的表面特征、疾病的风险以及对环境的反应】。随着对检测和分析技术的不

16、断发展,特别是与芯片等技术相结合,现在已成为第三代遗传标记,可以对疾病相关基因进行定位研究,尤其是多基因遗传病基因的定位,并将逐渐取代目前常用的第二代遗传标记微卫星标记技术而进入基因应用研究的领域。长期酒精摄入可引起人体众多系统损害。近年来,由于所谓的“酒桌文化的快速发展以及酒精的滥用,酒精性肝病的患者大大增加,过去比较少见的酒精性心肌病患者也呈增加了很多。酒精的过渡累积还可引起动脉粥样硬化,消化道癌,高血压,老人痴呆,冠心病等多种疾病。酒精的化学成分是乙醇,是第一章引言一种能与水完全互溶的极性小分子物质,口服摄入后,它很快经口腔、食道、胃、肠等多处吸收,在消化道内可以直接从生物膜进入血液循环

17、,整个消化道对乙醇都有吸收作用,然后通过胃肠黏膜的扩散借助血液循环均匀、迅速运输到全身各组织器官进行代谢利用。肝脏是乙醇代谢的主要器官,胃和肠道吸收的酒精经静脉系统进入肝脏,大部分的乙醇都在肝脏代谢,其代谢途径主要有以下条:乙醇脱氢酶乙醇氧化体系、微粒体乙醇氧化体系、氧化酶一过氧化氢酶体系和黄嘌呤氧化酶一过氧化氢酶体系。其中通过乙醇脱氢酶乙醇氧化体系途径代谢的乙醇约占代谢的%【。 ,和 ,是该代谢途径的关建酶,所以这两种酶是人体内参与乙醇代谢的主要酶。乙醇脱氢酶是催化乙醇向乙醛转化的关键酶,乙醛脱氢酶则是乙醛氧化为乙酸的关键酶,最终乙酸被氧化为水和二氧化碳进行代谢如图.。是一种广泛专一性的含锌

18、金属酶。以、或为辅酶在生物催化和生物医学领域都有较为广泛的应用。的活性增强可以加速乙醇向乙醛转化,而活性的降低则使乙醛向乙酸盐转化受到限制,同样使乙醛的浓度显著增高,导致乙醛在人体内累积。乙醛能够与机体多种蛋白质进行共价结合,产生乙醛一蛋白质复合物,引起蛋白酶失活、修复蛋白功能损害,自身抗体形成、谷胱甘肽耗竭、线粒体损伤和氧利用障碍,进而对人体组织和器官有高度的致毒,致突变,致癌的作用【】。此外,乙醛还具有拟交感活性作用,刺激肥大细胞释放血管活性物质使血管舒张而出现脸红、出汗、发音困难、心动过速、恶心和低血压【】。因此,乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的代谢活性高低会影响到体内乙醇的代谢快慢,进而直接影

19、响到人体的健康状态。硕士学位论文胎儿图.乙醇在肝脏内的氧化代谢通路.人类基因位于.,可以编码同源或异源二聚体的同工酶。同工酶是二聚体,有多种同工酶,常见的种根据其在肝脏内不同的催化动力特性和电泳泳动度以及对乙醇的不同的氧化速率,可分为型:型包括甜亚基, 亚基,.亚基,型为.亚基,型为廿亚基。型丰要在肝脏表达,它的米氏常数值最低而对乙醇的特异性最高,所以在乙醇代谢中起关键作用,种结构基因,分别编码【、丫亚单位。?基因在染色体上相邻近,它们有%的序列是一样的,组成一个约的族群,个基冈存在高度同源性,它们的长度均约 ,而且均包含个外显子。现已发现引言第一章和存在基因多态现象,不同基因型的和同工酶催化

20、乙醇向乙醛转化的活性有很大不同。但到目前为止的所有研究中,在任何种族中尚未发珊、彳删鳓册存在多态性】。基因位点有三个等位基因,即彳剧宰,和,分别编码卜、,个亚单位,他们亚基随机组合可形成种基因型:/、/、/、/、/、/。为野生型等位基因,它的活性是极低的,是第外显子发牛点突变,导致的第位氨基酸由精氨酸转换为组氨酸从而形成,虽变异,这种修饰产牛了一个的酶切位点。等位基因个体比等位基因个体乙醇脱氢酶活性强倍【。等位基因最早是在美国印第安纳波利斯市的黑人群体中发现,以后研究表明,该等位基因在美国西北部的土著人中也有表达,但是在欧美白种人和亚洲的同本人和中国人的发牛频率很低,均小于%。彳删佃宰则是在第

21、外显子发生 点突变形成的,同时导致第位氨基酸由精氨酸变为半胱氨酸,产生一个 的酶切位点。根据资料显示欧美白种人的等位基因频率在%以上,而在亚洲人中的等位基因频率大于%。所以亚洲人饮酒后比欧美人更容易使乙醇代谢为乙醛,发生脸红,头晕等酒精反应。因此,在中国人群中又的研究丰要涉及和两种等位基因。基因位于,有和两种等位基因,分别编码,丫亚基。是野牛型等位基因,彳剧叼黝刖,在第外显子发牛点突变,同时的位氨基酸由缬氨酸变为甲硫氨酸形成丫。等位基因个体比等位基因个体乙醇脱氢酶活性强.倍【。等通过对台湾的汉族人的乙醇代谢相关酶基因变异和酗酒症之间的关联研究,发现基因变异对是否成为酗酒者基本不起作用。所以研究

22、型变异与乙醇所致疾病的关系主要是彳刖曰车,和两种等位基因。迄今为止有种同工酶,常见的有种,位于肝细胞的线粒体内,对乙醛有较低的值,其余三个同工酶均位于包浆,对乙醛硕士学位论文的值是的一倍,因此推测他在体内对乙醛的氧化不起主要作用一。位于.,;和两种等位基因,是野生型等位基因,是第个外显予发生点突变,与此同时,酶的第位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸。野生垄具有活性,突变型不具有活性。但黝三删?/屹的活性只有/活性的%活性【】。突变型无活性的等位基因在欧洲人和非洲人中几乎缺乏,但在亚洲人种基因频率达到%【】。和基因位点存在多态性,不同的等位基因所编码的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶催化活性差异很大,这种差异与酒

23、精依赖综合症密切相关,和基因型的个体相对有彳朋,?和不容易发展成为酗酒者,这些已被大量文献予以报道【】。大量研究发珊朋和基因与各个组织器官的癌变、乙醇相关的肝脏病变、冠心病、迟发型老人痴呆、型糖尿病的并发症,多发性神经炎,血液中胆固醇的水平都有程度不同的联系【舶】。研究还发现对于第一个催化反应来说,携带有低活性的等位基因的个体会增加癌症的风险性,对于第二个催化反应来说,携带有没有活性的个体会增加癌症的风险性【。有关研究对此两基因型联合研究,各种基因型组合患病危险性如表.【,我们可以发现两酶具有一定活性时候患病风险性最少。因此,又寸和基因型进行鉴定有助于酒精中毒的流行病学研究和预测个体酒精相关疾

24、病的风险,为研究这两种基因变异与其他相关疾病的关系提供理论基础,为遗传病的咨询提供了遗传学基础。传统的检测和基因变异的主要技术方法是限制性片段长度多态性法,和单链构象多态性检测. ,【,此两种方法经过改进后成为分析和基因变异的常规方法。限制性内切酶分析的特异性虽高,但方法繁琐,且其筛查突变时常出现酶切不全的现象:是通过扩增后泳动变位,发现异常片段后再用测序证实,检测效率低,漏检率高。后来又有多种检测方法被运用于此两个基因的分析研究,例如,第一章引言,.等方法,但由于这些技术操作方法复杂,效率低以及所需成本高等多种因素,没有得到推广使用。近些年来,随着科学技术的发展,不少新的自动化的方法用于检测

25、或基因变异,例如】、分析【、分析【】等方法,但是,上述自动化方法因为成本相对较高等原因,在大规模人群筛查或检测多个位点突变中的应用受到一定限制。本研究主要运用高分辨率熔解曲线 ,分析方法来;不和基因同时分型。高分辨率熔解曲线分析技术是近些年新兴的一种基因多态性检测新技术。目前,已广泛应用于突变扫描、甲基化分析、基因分型、序列匹配等诸多领域,已成为生命科学研究中的热点技术。此方法主要是通过检测双链序列之间的解链差异来判断序列之间的差异。不同核酸分子的片段长短、序列的含量和分布等是不同的,因此在加热变性复性后所有的双链分子都会有自己相应的熔解曲线形状和位置【。技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来

26、对样品各种基因型进行区分。当扩增片段存在突变/时,目的产物经过变性.复性形成异源双链,异源双链中突变/位点因不匹配的,所以双链在升温过程中先解链,此时荧光染料从局部解链的分子上释放出来,根据荧光强度与温度曲线图可以判断是否具有突变/,同时不同的位点和杂合度都会影响熔解曲线的峰形。根据熔解温度的改变可区分野生型和纯合突变,而根据熔解曲线形状不同可区分野生型与杂合突变型。由于富含区会比富含区熔解温度高,所以不同样本的熔解温度是截然不同的。纯合子样品经过扩增之后还是纯合子,而杂合子样品经过扩增之后,产生两种同源双链和两种异源双链。分析过程中,随着扩增,荧光染料结合到重新复制的双链分子上,荧光信号逐渐

27、增强,进入扩增平台期后,荧光信号也进入平台期。随着温度的升高,双链逐渐解链,结合的染料释放出来,荧光值逐渐下降,直到温度升,所有的双链完全解链。通过检测荧光值,得到立荧光值随温度升高的变化而变化的熔解曲线。当产物片段一定的情况下,个别碱基的差异能够表现在熔硕士学位论文解曲线的差异上。高分辨率熔解曲线分析原理图见图.,另外,熔解温度是指当一半的双链解开时候的温度,也是反应不同样本的重要特性。高分辨率熔解曲线分析的丰要目的是能对单碱基的变化进行区分,因此对温度分辨率的要求很高。目前常规熔解曲线分析使用的非饱和性染料如等不仅对有抑制作用,而且在实验中的使用浓度非常低,不能够完全结合到双螺旋结构中的小

28、沟。因为非饱和染料的使用浓度未达到饱和,并且染料本身特性,即在双链解链的过程,它能够从已经解链的双链片段上脱离下来同时并且重新与还没有解链的双链结合,所以会导致结果不准确,不能够真实的反映熔解情况,严重的影响到检测的分辨率。荧光染料等饱和染料逐渐的取代了传统的非饱和染料,这种饱和染料因为结合能力强以及抑制作用很低而熔解曲线分析分辨率更高。双链饱和型荧光染料具有的这些特性使其筛查的灵敏度和特异性很高。与其他的基因多态性检测技术相比较,具有以下优点:成本很低,不需要昂贵的标记探针只需要饱和染料;在反应结束后可以直接进行熔解曲线反应分析,不需要任何的后续工作;具有高通量特点,单管反应可以检测或个样本

29、;所有反应都是闭关操作,极大的降低了样本被污染的可能性,并且经过分析的扩增产物还可以进行测序等后续工作,十分简单方便。本研究丰要利用了基因分型中的小片段法快速、准确的对和基因同时分型的方法,有助于预测个体乙醇相关疾病的风险,并且为其他基因进行多重分析提供参考。扩增片段越小,更能体现目的片段的序列差异,值差异越大,分型更加明显。小片段法要求是:.目的扩增片段大概是.。为了避免不同空间的温度差异导致的结果偏差,加入末端封闭的高低温内标来校正熔解曲线。.在反应之前加入双链的饱和染料如 。.模板的量要比较均一,引物具有好的特异性。.反应体系为时, 的加入量为。.在反应之前应加入矿物油防止产物挥发。本研

30、究采用的是双重结合小片段法基因方法快速筛查和基因型,为了避免不同片段间的值的重叠第一章 引言效应,所以通过改变扩增子大小以及通过在引物末端增加或来增大值差异,以便区分不同的目的片段。该方法可极大地提高和基因的分型率,可为中国人大规模的人群筛查和预测乙醇相关疾病风险提供有效的技术手段。?替图.高分辨率熔解曲线分析原理图. 受硕士学位论文表.两基因各种基因型组合的癌症患病风险性% :心 ./ .?. . . / .?. . .?.?.?. . . .: ,:第二章实验材料第二章实验材料.实验仪器及分析软件.凝胶成像系统:型,英国公司产品产品;凝胶成像系统,英国 公司。.酸度计:型,英国公司。.水浴

31、振荡器:.型,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。,美国公司。.高分辨率熔解曲线分析仪.台式高速离心机:.型,珠海黑马医学仪器有限公司。.电泳仪:型电泳仪,北京六一仪器厂。.纯水器: 型,法国公司。.基因扩增仪:型,美国公司;仪,公司。.低温冷冻离心机:美国 公司。.医用净化工作台:苏州净化设备厂。.和冰箱:华凌.冰箱,中国华凌集团有限公司。.分光光度计:美国公司。.净化工作台:上海新苗医疗器械制造有限公司。.低温冰箱:美国 公司。.制冰机:北京德天佑科技发展有限公司。.鼓风干燥箱:上海博迅实业有限公司医疗设备厂。.电子天平:.型,美国产品。.分析软件与相关网站:.引物设计软件: ,.,.。,.

32、高分辨率熔解曲线分析软件: 硕士学位论文序列比对软件与网站:. ,/:/./.?统计学分析软件:.。.实验试剂.外周血基因组提取试剂.无菌超纯水:法国纯水仪自制,.栅,经高压蒸汽灭菌,分装后,.保存,备用。 . / :称取. 分析纯,汕头市光华化学试剂厂产品;称量前需高温烤干置于 烧杯中,加入大约 的去离子水后搅拌溶解;溶解后继续加去离子水并将所得溶液定容至 后,分装后,高压蒸汽灭菌后,保存,备用。. /胺四乙酸溶液:称取. ?,置于 烧杯中;加入大约 的去离子水,充分搅拌溶解;然后用;调整好值后继续加去离子水将调节值至.大约 所得溶液定容至 ;适量分成小份,高压蒸汽灭菌后室温保存,备用。为美

33、国公司产品。.缓冲液:用/.和/ .以及/ 贮存液配制成。./.溶液:称量. 碱分装,北京鼎国生物技术有限责任公司产品置于 烧杯中,加入大约 的去离子水,充分搅拌溶解,溶解后加入约的浓盐酸调节值至.,调整好值后继续加去离子水将所得溶液定容至 ,适量分成小份。高压蒸汽灭菌后室温保存,备用。.%/十二烷基硫酸钠,美国公司产品:称量高纯度的置于烧杯中,加入大约的超纯水,加热溶第二章实验材料解,溶解后滴加数滴浓盐酸调节值至.,调整好值后继续加去离子水将所得溶液定容至后室温保存。.蛋白酶:美国公司产品。.缓冲液:用 .和贮存液配制成。.氯仿/异戊醇:分析纯,按体积比:配制。./?置于烧醋酸钠,.:称量.

34、杯中,加入约的超纯水搅拌溶解;溶解后加入冰醋酸调节值至.:调整好值后继续加去离子水将所得溶液定容至后室温保存。.饱和酚,.:北京鼎国生物技术有限责任公司产品。.无水乙醇:分析纯,汕头市光华化学试剂厂产品。.常规试剂.寡核苷酸引物:上海英骏生物技术有限公司合成,经纯化。.宝生物工程大连有限公司产品。. :宝生物大连有限公司产品。.普通 :北京鼎国生物技术有限责任公司产品。.电泳试剂.琼脂糖:西班牙公司产品。.溴化乙锭:在 双蒸水中加入 广州威佳生/ 物公司,磁力搅拌数小时完全溶解,溶解后置棕色瓶中室温保存,备用。.电泳上样缓冲液:.%溴酚蓝,.%甲苯腈蓝,%/蔗糖溶于超纯水中。.电泳缓冲液:称量

35、碱分装,北京鼎国生物技术./有限责任公司,硼酸汕头市化工厂,.,置于烧杯中,加入大约的超纯水溶解,溶解后继续加去离子。水定容至. :,北京全式金生物技术有限公司产品,电泳条带包括:, , , , , , , , 片段。硕士学位论文.高分辨率熔解曲线分析试剂.美国公司产品。.液体石蜡:广东光华化学厂有限公司产品。.外周血样品及样品.已知基因型样品对课题组所保存的随机人群的样品进行测序,获得例样本,包括扶下基因型? 。产。?净。?产。/熟/.方法学评价所用基因型样品.用于本研究的外周血样本共例标本收集自东莞市妇幼保健院,全基因组提取采用经典的苯酚/氯仿法抽提。.保存备用。第三章实验方法第三章实验方

36、法.技术路线图钨童潋髓证获得,卑,聿 ?。?年。产.彳伽/屹和彳三她叫叼六种基因型的样品,利用已知基因型的样品在上优化分析条件,进行方法的建立;利用已经建立的方法分析随机人群中的个个体的基因型,通过双盲分析法和不同批次重复实验的分析对该方法进行准确性和稳定性评价。本研究所用到的技术主要包括:技术、产物测序技术、高分辨率熔解曲线分析技术等。技术路线见图.。体系:.拖化:翌敏感性准确性 重复性 基因频率和基因一.:疆缝.:,. ?.进纶一一 .叠捡一.一型频垂的企托图.技术路线.样品基因组的提取及浓度测定.骨攘仿法抽提基因组:.吸取 抗凝的外周血置于聚丙烯离心管,加入.倍体积灭菌的双蒸水进行溶血反

37、应,离心分钟,弃除上清。.重复洗涤次直到看不到红色血影,剩下的是所需的白细胞沉淀。硕士学位论文缓冲液和.向该离心管内加入蛋白酶以及.的%,同时充分混匀,混匀后水浴震摇消化 .过夜直到肉眼观察溶液清亮并且没有沉淀即可。.消化后将液体转移至.离心管,加入倍体积饱和酚,充分混匀,离心分钟,用已剪的枪头取上清液移至另一个新的离心管中。.在上述的上清液中加入倍体积的酚/氯仿,充分混匀,离心分钟,用已剪的枪头取上清液移至另一个新的离心管中。.在上述的上清液中加入倍体积的氯仿/异戊醇:,充分混匀,离心分钟,用已剪的枪头取上清液移至另一个新的离。心管中。 .在上述的上清中加入/体积/醋酸钠.和倍体积的异丙醇轻

38、轻混匀,一放置分钟以上,放置后,离心分钟,弃除上清。.在贴壁的沉淀中加入 %乙醇洗涤,然后,离心分钟,弃除上清液,然后再重复洗涤。放置空气中干燥或真空干燥器吹干后加入灭菌超纯水溶解。溶解后.保存、备用。.基因组浓度测定:吸取“基因组样品,然后加入 灭菌超纯水稀释倍,再用紫外分光光度计测量和,自动计算浓度和/比值,来判断的纯度如何的纯度一般是/.,若.,则显示有污染:若.,则显示有蛋白质或酚等污染;如果比值小于.,那么需要用酚/氯仿重新抽提次;如果/,则显示溶液没有有机物污染。浓度计算公式为:样品浓度./稀释倍数/第三章实验方法.高分辨率熔解曲线分析方法的建立和评价.高分辨率熔解曲线分析方法的建

39、立.引物的设计和基因位于,而位于.,根据多态位点,分别在外显子和外显子的变异位点两端设计引物用来区分和基因的六种基因型。因为基因家族成员序列具有很高的序列同源性,所以在引物设计时需要尽量选取序列差异较大的区域结合.及 软件进行引物设计,来确保片段扩增的准确性。高分辨率熔解曲线分析对与小片段更加敏感,片段越短,单个碱基的序列差异反映在熔解曲线的差异就越明显。本研究中引物均小于,为了增加两个扩增子值差异,采取改变扩增子长度以及在引物末端增加或措施,为了排除一些干扰因素分型时候在体系中加入高低温内标。表.高低温内标和双重分析引物序列?.。譬墨鬻怨乏盥丛碱粥从队订凹丌 :? 一 :口【虹泠,.一 、。

40、” ?. ,. .叫仃?僦? .;, .?硕士学位论文 扩增体系与循环参数和同时扩增采用肛反应体系:加入基因组,和上下游引物各. 缓冲液, ,., ,., ,高温和低温内标各., 。循环参数:预变性分钟,然后秒,秒,延伸秒,共个循环;保温分钟,最后变性秒,降至室温。扩增引物序列、高低温序列、各扩增片段引物熔解温度见表.。.高分辨率熔解曲线分析扩增结束后在 .,上扫描,得到高分辨率熔解曲线:设定熔解的起始温度为“和终止温度.为“,待机温度为。结果分析是采用。.双重高分辨率熔解曲线分析方法的评价.双重高分辨率熔解曲线分析检测体系的灵敏度和准确性的评价将份待测基因组样品在四周内分四批进行分析,每周对

41、一个批次的样品进行基因型分析。为了检测建立的双重高分辨率熔解曲线分析体系的灵敏度和准确性,从检测的每种基因型样品中,各种基因型中选择一定比例具有代表性的样品进行直接测序检验,然后由第三方对分析和测序两种方法所得的结果进行对比。.双重高分辨率熔解曲线分析体系的重复性和稳定性的评价为了排除单次实验结果的随机误差,检测所建立的双重高分辨率熔解曲线分析体系的重复性和稳定性,我们选取了和基因的野生纯合子以及突变纯合子各个样本进行高分辨率熔解曲线分析次重复实验,体系以及循环参数同上。.双重高分辨率熔解曲线分析体系的敏感性评价第三章实验方法为了评价建立的双重高分辨率熔解曲线分析敏感性,我们对基因的野生纯合子

42、和突变纯合子样本进行了倍稀释法,进行个浓度检测,分别是, , ,. ,. ,体系以及循环参数同上。.等位基因频率的计算和?平衡的判定设定野生型基因频率为,突变型基因频率为, 。为基因型的基因型频率;为基因型的基因型频率,为基因型的基因型频率。根据样品的基因型计算各种等位基因的频率,然后通过检验所选取群体样本的和等位基因频率和基因型频率分布是否符合平衡。.结果分析.统计学分析采用.统计学软件,进行以下二方面的分析:.稳定性及重复性分析:计算和基因型纯合子的熔解的变异系数,看其范围大小。.平衡的分析:假设野生型等位基因频率为,突变型等位基因频率为,则,依据?平衡定律,即。这里,从基因型的基因型频率为,缸基因型的基因型频率为,基因型的基因型频率为。根据例无关个体的基因型频率分布情况,可以推算出每种等位基因的基因频率,并通过检验判断所选取的随