纸层析法分离氨基酸

1、1 纸层析法分离氨基酸纸层析法分离氨基酸 2 实验目的实验目的 1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析 法的操作技术法的操作技术 (包括点样、平衡、展层、显色、包括点样、平衡、展层、显色、 鉴定及定量鉴定及定量)。 2、学习未知样品的氨基酸成分、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及水解、层析及 鉴定鉴定)分析的方法。分析的方法。 3 实验原理实验原理 层析法又叫色层分离法、色谱分析法或色谱法。层析法又叫色层分离法、色谱分析法或色谱法。 1944 年应用滤纸作为固定支持物的年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析纸层析”诞生以来，层析技诞生以来，层析技 术的发

2、展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和 高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也 迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既 可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制 备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛 应用而又必不可少的分析工具之一。应用而又必不可少的分析工具之一。 4 分配层

3、析分配层析 分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中 的分配情况不同而使之得到分离的方法。的分配情况不同而使之得到分离的方法。 分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相 (固定相固定相 和流动相和流动相)间分配系数的不同。间分配系数的不同。 分配系数分配系数(K)的定义是：的定义是： K=溶质在固定相的浓度溶质在固定相的浓度(CS)/溶质在流动相的浓度溶质在流动相的浓度(CL) 5 二、纸层析 ( (一一) ) 原理原理 纸上层析实际上是以滤纸纤维的纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相结合水为

4、固定相， 而以而以有机溶剂有机溶剂( (与水不相混溶或部分混溶与水不相混溶或部分混溶) )作为流动相作为流动相。 展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相 之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数， 移动速度因此不同，从而达到分离的目的。移动速度因此不同，从而达到分离的目的。 6 7 溶质在滤纸上移动的速率可用溶质在滤纸上移动的速率可用R Rf f值值 表示：表示： R Rf f= X/ Y= X/ Y 式中式中X：溶质斑点中心的移动距离溶质斑点中心的移动距离 Y Y：溶剂前沿移动的距

5、离溶剂前沿移动的距离 R Rf f值决定于分配系数。值决定于分配系数。 不同物质的分配系数不同，不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由值也不相同，由 此可以根据此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。值的大小对物质进行定性分析。 8 (二二) 影响影响Rf值的主要因素值的主要因素 物质的结构和极性物质的结构和极性 物质的结构和分子极性是影响物质的结构和分子极性是影响R Rf f值的主要因素。值的主要因素。极性较大极性较大 的物质，在水中的溶解度较大，的物质，在水中的溶解度较大，其其R Rf f值就较小值就较小，反之亦然。，反之亦然。 2.2.滤纸滤纸 不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相

6、同，因此结合的不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的 水量水量不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同 型号的滤纸上进行层析时，所得到的型号的滤纸上进行层析时，所得到的R Rf f值也不相同。值也不相同。 此外，滤纸上所含的此外，滤纸上所含的杂质杂质也会影响也会影响R Rf f值。值。 9 3.3.层析所用的溶剂层析所用的溶剂 同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，R Rf f值不同。所值不同。所 以溶剂的配制和使用必须严格，才能使以溶剂的配制和使用必须严格，才能使R Rf f值的重现

7、性好。在好值的重现性好。在好 的溶剂系统中被分离物质的的溶剂系统中被分离物质的R Rf f值应在值应在0.05-0.850.05-0.85之间，样品中之间，样品中 被分离组分的被分离组分的R Rf f之差最好大于之差最好大于0.050.05。 溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使 用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸、用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸、 碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等 10 4.pH4.pH值值 溶剂和样品的溶剂和样品的pHpH值会值会影响物质的

8、解离影响物质的解离，从而影响物质的，从而影响物质的 极性和溶解度，使极性和溶解度，使R Rf f值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的 含水量增高，使极性物质的含水量增高，使极性物质的R Rf f值增加；反之则降低。值增加；反之则降低。 为了避免或减少为了避免或减少pHpH值对值对R Rf f值的影响，可将滤纸和溶剂用值的影响，可将滤纸和溶剂用 缓冲溶液处理，使之保持一定的缓冲溶液处理，使之保持一定的pHpH值。值。 5.5.温度温度 温度能温度能影响物质在两相中的溶解度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；，即影响分配系数； 也影响滤纸纤维的也影响滤纸纤维的

9、水合作用水合作用，即影响固定相的体积，即影响固定相的体积. .所以温度所以温度 的改变使的改变使R Rf f值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。 11 6.6.展开方式展开方式 同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同 的展开方式进行层析时，所得到的的展开方式进行层析时，所得到的R Rf f 值不相同。用 值不相同。用下行法下行法展展 开时，开时，R Rf f值较大；用值较大；用上行法上行法展开时，展开时，R Rf f值较小；用值较小；用圆形滤纸圆形滤纸 层析层析时，由于内圈较外圈小，限制了

10、溶剂的流动，时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，R Rf f值也较值也较 小。小。 7.7.样品溶液中杂质样品溶液中杂质 样品溶液中存在杂质时，有时对样品溶液中存在杂质时，有时对R Rf f值有所影响。例如：值有所影响。例如： 氯化钠的存在会影响氨基酸的氯化钠的存在会影响氨基酸的R Rf f 值。 值。 12 (三三) 操作方法操作方法 1.1.样品处理样品处理 用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定 的的pHpH值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需 稀释。稀释。 2.2.点样

11、点样 将滤纸裁成适当大小，用将滤纸裁成适当大小，用铅笔铅笔在距边线在距边线2cm2cm左右划一直左右划一直 线线( (称为原线称为原线) )，线上每隔，线上每隔2-3cm2-3cm划一圆点划一圆点( (称为原点称为原点) )。然后。然后 用点样器用点样器( (定性分析可用普通毛细管，定量分析需用微量注定性分析可用普通毛细管，定量分析需用微量注 射器射器) )轻轻点在原点上。样品点的直径约轻轻点在原点上。样品点的直径约0.3-0.5cm0.3-0.5cm。点样的。点样的 量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，一般每一样品的量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，一般每一样品的 量为量为5-30g5

12、-30g。点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷。点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷 风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否 则会出现斑点畸形现象。则会出现斑点畸形现象。 13 14 3.3.平衡平衡 点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液 系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡平衡”。若不经。若不经 平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中，平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中， 滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面

13、挥发，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发， 从而改变溶剂系统的组成从而改变溶剂系统的组成, ,严重影响层析效果。平衡一严重影响层析效果。平衡一 般在密闭的层析缸内进行。般在密闭的层析缸内进行。 15 4.4.展开展开 平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，溶剂液平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，溶剂液 面距原线距离约面距原线距离约1cm1cm，此时即开始展开。当溶剂前沿到达滤纸另，此时即开始展开。当溶剂前沿到达滤纸另 一端一端0.5-1cm0.5-1cm处时，展开结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标处时，展开结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标 记，晾干或用冷风吹干。记

14、，晾干或用冷风吹干。 按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环 行三种方式。行三种方式。 (1) (1) 上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因 毛细管引力的作用从下向上流动。毛细管引力的作用从下向上流动。 上行法操作简单，重现性好，上行法操作简单，重现性好， 是最常用的展开方法，但展开时间较长。是最常用的展开方法，但展开时间较长。 (2) (2) 下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸 点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作

15、用自上而下流动。点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。 下行法展开速度快，但下行法展开速度快，但R Rf f值的重现性较差，斑点易扩散。值的重现性较差，斑点易扩散。 16 (3) (3) 环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸 距圆心距圆心1cm1cm左右的环形线左右的环形线( (原线原线) )上。滤纸水平放置，上。滤纸水平放置， 溶剂由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向溶剂由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向 流动。由于溶剂向圆周方向扩散，所以展开的图谱流动。由于溶剂向圆周方向扩散，所以展开的图谱 呈弧形。用环行法展开时，最好使用无

16、方向性的特呈弧形。用环行法展开时，最好使用无方向性的特 制滤纸。制滤纸。 （4 4）双向展开法：如果样品组分较多，用一种）双向展开法：如果样品组分较多，用一种 溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时，溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时， 可将样品点在方形滤纸的一角，用一种溶剂系统展可将样品点在方形滤纸的一角，用一种溶剂系统展 开后吹干溶剂，将滤纸转动开后吹干溶剂，将滤纸转动9090o o后再用另一种溶剂系后再用另一种溶剂系 统（常为碱性）展开，这称为统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法双向展开法”。 17 5.5.显色显色 为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，采为了显示层

17、析斑点位置，可根据物质的性质不同，采 用显色剂显示或紫外光显示。用显色剂显示或紫外光显示。 (1) (1) 显色剂显示：显色剂显示： 被分离物质与显色剂生成有颜色的被分离物质与显色剂生成有颜色的 化合物，显示斑点位置。常用喷雾法化合物，显示斑点位置。常用喷雾法 、浸渍法或涂刷法。、浸渍法或涂刷法。 (2) (2) 紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核 苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维生苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维生 素素B B1 1、B B2 2等，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质的斑等，所以可在紫外光照射

18、下观察到被分离物质的斑 点。点。 6.6.定性分析定性分析 层析后的斑点显示出来后，计算出各斑点的层析后的斑点显示出来后，计算出各斑点的R Rf f值，就值，就 可以对物质进行定性。可以对物质进行定性。 18 7.7.定量分析定量分析 对被分离的物质进行定量的方法很多，常用的有：对被分离的物质进行定量的方法很多，常用的有： (1) (1) 剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱后，剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱后， 通过分光光度计进行比色定量。通过分光光度计进行比色定量。 (2) (2) 直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤纸直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤纸 上斑点颜

19、色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积可求上斑点颜色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积可求 出待测物的含量。出待测物的含量。 (3) (3) 面积测量法：实验证明，圆形或椭圆形斑点的面面积测量法：实验证明，圆形或椭圆形斑点的面 积与物质含量的对数成正比。所以，可用测量斑点面积的积与物质含量的对数成正比。所以，可用测量斑点面积的 方法求得物质的含量。方法求得物质的含量。 19 20 实验材料与试剂实验材料与试剂 实验试剂实验试剂 1、氨基酸标准液、氨基酸标准液(1mg/mL) 五种氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸五种氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸,脯氨酸分别配脯氨酸分别配 制成一定浓度的溶液。制

20、成一定浓度的溶液。 2、展开剂是：正丁醇：甲酸：水、展开剂是：正丁醇：甲酸：水=15:3:2 (正丁醇：水：乙酸=4：1：1) 3、0.2%茚三酮丙酮溶液。茚三酮丙酮溶液。 4、氨基酸混合液、氨基酸混合液(每种氨基酸每种氨基酸500mg/mL)。 21 实验器材实验器材: 1、滤纸。、滤纸。 2、培养皿、培养皿(直径直径115mm)。 3、电热鼓风干燥箱。、电热鼓风干燥箱。 4、喷雾器及吹风机。、喷雾器及吹风机。 5、点样管及点样架。、点样管及点样架。 6、针、线、尺。、针、线、尺。 7、烧杯、烧杯(50mL)。 22 实验操作实验操作 （一）、标准氨基酸纸上层析（一）、标准氨基酸纸上层析 1

21、、单向上行层析、单向上行层析 (1)、氨基酸、氨基酸Rf值的测定值的测定 A、滤纸滤纸：选用国产滤纸，：选用国产滤纸，10cm20cm，在距纸边，在距纸边 2cm处，用铅笔轻轻划一条线，于线上每隔处，用铅笔轻轻划一条线，于线上每隔2cm处处 画一小圆圈作为点样处，圈直径不超过画一小圆圈作为点样处，圈直径不超过0.3cm。 23 B、点样点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清，：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清， 氨基酸的点样量以每种氨基酸含氨基酸的点样量以每种氨基酸含 520g为宜，用点样管为宜，用点样管(也可用血色也可用血色 素管代替素管代替)

22、吸取氨基酸样品吸取氨基酸样品10g(1g/L)，与滤纸垂直方向轻轻碰触点，与滤纸垂直方向轻轻碰触点 样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.3cm之内，之内， 点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可 用一加热装置用一加热装置(如吹风机如吹风机)，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏， 特别是谷氨酰胺破坏，影响定量结果。特别是谷氨酰胺破坏，影响定量结果。 将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸 的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成 溶剂前沿不齐，影响溶剂前沿不齐，影响Rf值。值。 24 C、展层展层：将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内：将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内 (注意滤纸不要注意滤纸不要 碰皿壁碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约，当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，