DNA浓度和纯度的测定

1、dna浓度与纯度得测定一、原理DNA或RNA链上碱基得苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在 260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA得光密度OD260不仅与总含量有关, 也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为lug/ m 1时，DNA钠盐得OD 2 6 0 =0、02 当 O D260= 1 时，dsDNA 浓度约为 50 u g / mlssDNA浓度约为37Pg/m 1RNA浓度约为4 0 ug /ml寡核昔酸浓度约为3 0 M g / ml （you y u底物不同有 差异）当DNA样品中含有蛋白质、酚或其她小分子污染物时,会影响DN A吸光度 得准确测定.一般悄况下同时检

2、测同一样品得OD260、OD2 8 0与OD230,计算 其比值来衡量样品得纯度。经验值：纯 DNA： OD2 6 0 / 0 D 2 8 0 1、8 （1、9,表明有 RNA 污染;VI、6 , 表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA： 1、7OD260/OD280V2、0 （1、7时表明有蛋白质或酚污染； 2、0时表明可能有异硫氤酸残存）若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可 使用方案二得方法或其她方法进行估算.二、材料、试剂及器具1、材料提取得PUC 1 9样品、PUC 1 9标准样品2、试剂灭菌重蒸水，TE缓冲液3、器皿石英比色皿；UV-24 0紫外分光光度计二、

3、实验步骤1、UV-240紫外分光光度计开机预热1 0 mi n、2、用重蒸水洗涤石英比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室 得S池架上，关上盖板.3、设定狭缝后校零。4、将标准样品与待测样品适当稀释（DNA 5口1或RNA 4 u 1用TE 缓冲液稀释至1 000 u 1)后,记录编号与稀释度。5、把装有标准样品或待测样品得比色皿放进样品室得S架上，关闭盖板.6、设定紫外光波长，分别测定230 n m、26 0 nm、280nm波长时得OD值.7、计算待测样品得浓度与纯度。DN A样品得浓度(Mg/ P 1 )： OD2 60X稀释倍数X50/ 1 00 0RNA样品得浓度(Mg/

4、Pl) :OD260X稀释倍数X40/1000方案二溟化乙锭法、原理澳化乙锭（EB）就是一种嵌入型染料，其上得一个扁平得基团可插入到DN A或RNA链得堆积碱基之间。澳化乙锭得嵌入基团与碱基得接近使二者紧密结 合。DNA吸收254nm得紫外辐射并传递能量给EB,而EB本身在3 0 2nm与 366nm处有光吸收。吸收得能量在59 0 nm处释放，并表现为橙红色荧光。结合得 EB得荧光产率远大于游离EB得荧光产率。EB结合量得多少与DNA得大小与 构型有关，而荧光强度正比于嵌入漠化乙锭得量.对于单一构型得同种DNA样品 来说，澳化乙锭得嵌入量与样品溶液得DNA含量成正比。二、材料、试剂及器具1、

5、标准DA样品：已知浓度得线型DNA,以TE稀释为梯度浓度得一系列标准 样品。2、质粒DNA得酶切样品（待测）3、澳化乙锭（EB）5u g / ml:以PH8、0得TE稀释1 Omg/m 1母液而得。4、紫外透射仪。三、操作步骤黑色塑料板（或其她替代物）在其上点上两排澳化乙锭2 ul液滴，每排六点取标准样品2 ul与第一排澳化乙锭混匀，则各点得DNA浓度分别为（单位：ng/ul） :2 0、15、10、5、2、1取待测样品经过梯度稀释后，各加2 u 1于第二排得澳化乙锭上混匀梯度稀释（单位：n 1）把以上塑料板放到紫外投射仪得样品台上关好样品室门。以短波紫外光激发荧光。观察每一点得荧光强度或拍照

6、。比较上下两排得亮度，确定待测样品得浓度四、注意事项1、标准样品含单一种类得DNA,且大小与待测样品相近.2、待测样品与标准样品使用同样得体积、3、EB具有中度毒性、强致癌性，操作时切记戴手套，切勿沾染到衣物、皮肤、 眼晴、口鼻等。4、沾有EB得用具使用完毕统一集中于回收容器中，经净化处理后方可弃。五、实验报告1、绘出所观察到得现象（以点得密度代表亮度）2、请估算待测DA原液得浓度。要求记录测定原始数据，计算待测样品得浓度与纯度；并对您得实验结果作出评 价，提出下一步提纯工作得设想。琼脂糖礙胶电泳检测DNA采用1 %得琼脂糖进行电泳，实验步骤为：a、制胶:称取0.2g琼脂糖转入三角瓶中，加入2 OmL lxTAE,混匀，于微 波炉中加热融化。稍冷却后，加入lpL EB溶液（lOmg /mL）,倒入预先插 入梳子得凝胶槽（12cmxl2cm）内。待胶凝固后，竖直拔出梳子；b、上样:在水平电泳槽中加入lxTAE电泳缓冲液，将凝胶槽转移到电泳槽 （HE-120，上海天能科技有限公司）中，保证缓冲液得液面高于凝胶表面。在封口膜上将5pL DNA样品与lpL 6x 1 oadi n g b uf f er混合均匀,然后小心得加 入到凝胶得点样孔中。Marker为入DNA / Hin d I II,上样量为5pL。c、跑胶：确认样品孔所