工业微生物的菌种选育和发酵

1、 第一节第一节 概述概述 第二节第二节 自然选育自然选育 第三节第三节 诱变育种诱变育种 第四节第四节 杂交育种杂交育种 第一节 概述 一、工业微生物 二、发酵工业对菌种的要求 三、菌种选育的目的 四、菌种选育的基本理论 五、菌种来源 1.细菌 第一节第一节 概述概述 一、工业微生物一、工业微生物 生产多种抗生素生产多种抗生素 2. 2.放线菌（放线菌（） 酵母菌是一群单细胞的真核微生物酵母菌是一群单细胞的真核微生物, ,其形态因种而异其形态因种而异. .通常通常 为圆形、卵圆形或椭圆形。也有特殊形态，如柠檬形、三角形为圆形、卵圆形或椭圆形。也有特殊形态，如柠檬形、三角形 、藕节状、腊肠形，假

2、菌丝等、藕节状、腊肠形，假菌丝等 。 3. 3.酵母菌酵母菌 许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可通过藻类将 CO2转变为石油；国外还有从“藻类农场”获得氢能的报道。 4 4. .藻类藻类 二、发酵工业对菌种的要求 1.生产力： 能在廉价的培养基上迅速生长，代谢产物的产量高，其它代谢产 物少 2.操作性： 发酵条件易控制，菌种改造的可操作性要强（有关合成产物的途 径尽可能地简单），产品易分离 3.稳定性： 抗杂菌和抗噬菌体能力强，遗传性状稳定，菌种不易变异退化 4.安全性： 是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素 第一节第一节 概述概述 三、菌种选育的目的 1、提高发酵产量 2、改进菌种

3、的性能 3、产生新的发酵产物 4、去除多余的组分 第一节第一节 概述概述 （一）菌种选育的理论基础 （二）突变诱发的过程 四、菌种选育的基本理论 第一节第一节 概述概述 （一）菌种选育的理论基础 遗传和变异 基因突变是指由于染色体和基因本身的变化 而产生的遗传性状的变异。 前突变：诱变剂所造成的前突变：诱变剂所造成的DNADNA分子的某一位置的结构改分子的某一位置的结构改 变称为前突变。变称为前突变。 影响前突变产影响前突变产 生的的因素生的的因素 细胞对诱变剂的透性细胞对诱变剂的透性 细胞质和酶的影响细胞质和酶的影响 基因所处的状态基因所处的状态 1 1、前突变形成、前突变形成 （二）突变诱

4、发的过程 1 1）光复活作用）光复活作用 2 2）切补修复）切补修复 3 3）重组修复）重组修复 4 4）SOSSOS修复系统修复系统（多数诱变来源于此）（多数诱变来源于此） 5 5）DNADNA多聚酶的校正作用多聚酶的校正作用 2 2、DNADNA损伤的修复损伤的修复 （二）突变诱发的过程 （二）突变诱发的过程 （二）突变诱发的过程（二）突变诱发的过程 SOS修复系统修复系统 它允许新生的它允许新生的DNA链越过胸腺嘧啶二聚体而生长。链越过胸腺嘧啶二聚体而生长。 其代价是保真度的极大降低，这是一个错误潜伏的过程。其代价是保真度的极大降低，这是一个错误潜伏的过程。 （二）突变诱发的过程 校正差

5、错：校正差错：光复活作用、切补修复光复活作用、切补修复 引起差错：引起差错：重组修复、重组修复、SOSSOS修复系统。修复系统。 3 3、从前突变到突变、从前突变到突变 （二）突变诱发的过程 表型迟延：表型的改变落后于基因型的改变表型迟延：表型的改变落后于基因型的改变 分离型迟延分离型迟延 ( (基因杂合基因杂合) ) 经诱变处理后，细胞中的基因处于经诱变处理后，细胞中的基因处于 不纯的状态，突变型基因由于属于隐不纯的状态，突变型基因由于属于隐 性基因而暂时得不到表达，需经过复性基因而暂时得不到表达，需经过复 制、分离，在细胞中处于纯的状态时，制、分离，在细胞中处于纯的状态时， 其性状才得以表

6、达。其性状才得以表达。 生理性迟延生理性迟延 新的表型必须等到原有基因的产物新的表型必须等到原有基因的产物 稀释到某一程度后才能表现出来稀释到某一程度后才能表现出来。 4 4、从突变到突变型、从突变到突变型 （二）突变诱发的过程 从菌种保藏中心购买 育种 从自然界中筛选 诱变 杂交育种 基因工程育种 四、菌种来源 第一节第一节 概述概述 source 1 国际承认的中国培养物保藏单位 武汉大学的 中国典型培养物保藏中心 CCTCC。保藏了几乎所有的培 养物。 中科院微生物研究所的中科院微生物研究所的 中国普通微生物菌种保藏管理中心中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCCCGMCC。保藏。保藏

7、 有普通菌种有普通菌种。 (CGMCC) 中国微生物菌种保藏管理委员会中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCMCCCCM管理机构管理机构 订购程序 申请 生物安全性说明 确认 订货 一、定义 二、方法 三、特点及应用 第二节 自然选育 自然选育：自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，在生产过程中，不经过人工诱变处理， 根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。 自发突变：自发突变：就是指某些微生物在没有人工参与下就是指某些微生物在没有人工参与下 所发生的那些突变。所发生的那些突变。 一、定义一、定义 多因素低剂量的诱变效应多因素低剂量的诱变效应 互变

8、异构效应互变异构效应 第二节 自然选育 二、菌种自然选育方法二、菌种自然选育方法 单菌落分离法单菌落分离法 菌种菌种单细胞悬液单细胞悬液琼脂板分离琼脂板分离挑取单菌落挑取单菌落 测定生产能力测定生产能力 细菌：转种到新鲜肉汤培养基中培养细菌：转种到新鲜肉汤培养基中培养 放线菌、霉菌：石英砂震荡打散孢子，棉花或滤纸过滤放线菌、霉菌：石英砂震荡打散孢子，棉花或滤纸过滤 第二节 自然选育 用刚果红染色法鉴定筛选降 解纤维素的菌株 羧甲基纤维素钠作培养物 抗生素筛选 检定菌培养，加上发酵液 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角 瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌 种。 三

9、、特点及应用 简单易行、自发突变的效率低。 纯化菌种，防止菌种衰退、稳定产量和提高产 量 第二节 自然选育 1、目前生产用菌种的特点 多为人工诱变而来。 代谢调控系统失控。 生活力比野生菌株弱。 容易发生变异。 菌种衰退原因的分析菌种衰退原因的分析 2、菌种遗传特性的改变、菌种遗传特性的改变 1 1）异核现象）异核现象-导致菌种这一微生物群体发生变异导致菌种这一微生物群体发生变异 2 2）自发突变）自发突变 3 3）回复突变或产生分离子）回复突变或产生分离子-形成具有不同基因型的形成具有不同基因型的 个体个体 异核体异核体 孢子遗传特性和孢子遗传特性和 生长速度不同生长速度不同 菌种遗传特性发

10、生改变菌种遗传特性发生改变相邻菌丝细胞吻合相邻菌丝细胞吻合 回复突变：回复突变：突变基因再次发生突变又恢复原来的基因，这类突变称为回突变基因再次发生突变又恢复原来的基因，这类突变称为回 复突变。复突变。 1 1）一个菌种不是纯一的群体。）一个菌种不是纯一的群体。 3、菌种生理状态的改变、菌种生理状态的改变 2 2）培养基营养成分的影响）培养基营养成分的影响 3 3）某些培养条件下，某些基因所处的状态不同，）某些培养条件下，某些基因所处的状态不同， 使得菌种的生理状态不同。使得菌种的生理状态不同。 主要是因为培养条件不适当。主要是因为培养条件不适当。 一、定义及特点 二、诱变剂 三、诱变育种的主

11、要环节 第三节诱 变 育 种 第三节诱 变 育 种 诱变育种： 通过诱变剂处理提高菌种的突变频率，扩大变 异幅度，然后采用简便、高效的筛选方法，从 中选出具有优良特性的变异菌株的方法。 特点： 速度快、收效大、方法简便，但缺乏定向性。 生物诱变剂生物诱变剂 化学诱变剂化学诱变剂 物理诱变剂物理诱变剂 紫外线 快中子 NTG 亚硝酸 烷化剂 噬菌体 转座子 烷化剂是重要的诱变剂，带有活性烷基，通过烷化磷酸基、烷化剂是重要的诱变剂，带有活性烷基，通过烷化磷酸基、 碱基与碱基与DNADNA作用。作用。 第三节诱 变 育 种 第三节诱 变 育 种 突变的诱发突变的诱发 突变株的筛选突变株的筛选 突变高

12、产基因的表现突变高产基因的表现 1.出发菌株的选择 2.诱变处理 举例 3.筛选 4.突变菌株高产基因的表达 第三节诱 变 育 种 选择纯种菌株（排除异核体） 优良性状的菌株（产生孢子、生长速度） 对诱变剂敏感的菌株 同时选择几株不同的优良菌株 1.1.出发菌株的选择出发菌株的选择 碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但 很少使用，回复突变率高，效果不大。 亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损 伤较多。其中甲基磺酸乙酯常被称为伤较多。其中甲基磺酸乙酯常被称为”超诱变超诱变 剂剂”，是毒性最小的诱变剂之一。，是毒性最小的诱变剂之一。 紫外线仍十分有效

13、。电离辐射是造成染色体巨大损紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损 伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的突变。但它伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的突变。但它 可能影响邻近基因的性能。可能影响邻近基因的性能。 2.2.诱变处理诱变处理 高剂量：致死率90%-99.9% 变异幅度大，但负变株多 低剂量：致死率75%-80% 负变株少，且突变菌株稳定 （1 1）菌种的生理状态）菌种的生理状态 碱基类似物、亚硝基胍碱基类似物、亚硝基胍分裂中的分裂中的DNADNA UVUV、亚硝酸、烷化剂、电离辐射、亚硝酸、烷化剂、电离辐射都有效都有效。 （2 2）辅助剂）辅助剂 核酸碱基、氯霉素、氨基酸、氯化锂

14、、重金属离子等核酸碱基、氯霉素、氨基酸、氯化锂、重金属离子等 （3 3）温度、氧、）温度、氧、pHpH值、可见光等值、可见光等 诱变的有效波长是 253-265nm。 诱变效果由紫外强 度、距离和照射时 间决定 可见光能够激活光 复活酶，将紫外诱 变的DNA修复。 举例（紫外线育种） 紫外诱变机理 DNA对紫外线有强 烈的吸收作用，引 起结构的变化 形成嘧啶二聚体， 破坏腺嘌呤的正常 掺入和碱基的正常 配对。链间二聚体 阻碍双链解开。 制备菌悬液 细菌要处于对数生长期，此时，生长状态同步，生理 活性一致，细胞浓度较高。霉菌、放线菌要用孢子。 保证菌悬液均匀 用玻璃珠振荡，使细胞均匀分散。 维持

15、一定的细胞浓度 真菌和酵母一般是106-107个/毫升，放线菌和细菌是10 8个/毫升。 紫外诱变步骤 培养 达到要求时间后，盖 上培养皿盖，在红外 灯下稀释分离，涂平 板，用黑布包扎，在 适当温度下培养。 功率为功率为15W15W的紫外灯的紫外灯 照射距离：照射距离：30cm30cm 照射时间：几秒照射时间：几秒10min10min 处理过程应在暗室的红光下操作（处理过程应在暗室的红光下操作（why?why?） 诱变：单细胞悬液放置于培养皿中，放入无菌搅拌子。将 培养皿置于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器和培养皿盖， 打开紫外灯，计时。 v 培养：培养：达到要求时 间后，盖上培养皿 盖，在红外灯

16、下稀 释分离，涂平板， 用黑布包扎，在适 当温度下培养。 v3.筛选 根据步骤可以分为初筛和复筛 初筛 量大，条件粗放。一个菌种进一个摇瓶。 复筛 条件要求应逐步提高。 每个菌株进35个摇瓶，如果生产能力继续保 持优异，再重复筛选几次。 注意 亲株作对照。 复筛后的优良菌株要考查其稳定性、菌种特性和最适培养条件 根据操作方法可分为随机筛选和理性化筛 选 q 随机筛选随机筛选 q 理性化筛选理性化筛选 运用遗传学、生物化学的原理，根运用遗传学、生物化学的原理，根 据产物已知的或可能的生物合成途径、据产物已知的或可能的生物合成途径、 代谢调控机制和分子结构来进行设计代谢调控机制和分子结构来进行设计

17、 和采用一些筛选方法。从而打破微生和采用一些筛选方法。从而打破微生 物原有的代谢调控机制，获得能大量物原有的代谢调控机制，获得能大量 形成产物的高产突变株形成产物的高产突变株 经过诱变处理后，进行平板分离，随经过诱变处理后，进行平板分离，随 机挑选单菌落，筛选高产菌株机挑选单菌落，筛选高产菌株 1 1）摇瓶筛选法）摇瓶筛选法 单菌落单菌落传种斜面传种斜面模拟发酵瓶模拟发酵瓶测定发酵能力测定发酵能力 2 2）琼脂块筛选法）琼脂块筛选法 打孔取块打孔取块 鉴定平板测定发酵能力鉴定平板测定发酵能力 ( (须经摇瓶复筛须经摇瓶复筛) ) 随机筛选 3 3）筛选自动化和筛选工具微型化）筛选自动化和筛选工

18、具微型化 随机筛选 96孔板高通量孵育筛选 随机筛选随机筛选 1.1.初级代谢产物高产菌株的筛选初级代谢产物高产菌株的筛选 筛选营养缺陷型筛选营养缺陷型 理性化筛选 理性化筛选 筛选细胞膜透性改变的突变株筛选细胞膜透性改变的突变株 使之大量分泌终产物，以降低细胞内终产物浓度，从使之大量分泌终产物，以降低细胞内终产物浓度，从 而避免终产物反馈调节。而避免终产物反馈调节。 谷氨酸棒杆菌生 物素营养缺陷型 细胞膜通透性 谷氨酸分 泌至胞外 理性化筛选 筛选结构类似物抗性突变株筛选结构类似物抗性突变株 用与代谢产物结构类似的化合物处理微生物细胞用与代谢产物结构类似的化合物处理微生物细胞 群体，杀死或抑

19、制绝大多数细胞，选出能产生该代谢群体，杀死或抑制绝大多数细胞，选出能产生该代谢 物的抗反馈突变株。物的抗反馈突变株。 理性化筛选 2.2.次级代谢产物次级代谢产物( (主要是抗生素主要是抗生素) )高产菌株的筛选高产菌株的筛选 (1)(1)利用营养缺陷型筛选（渗漏缺陷型）利用营养缺陷型筛选（渗漏缺陷型） 渗漏缺陷型：遗传性障碍不完全的营养缺陷型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧渗漏缺陷型：遗传性障碍不完全的营养缺陷型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧 失，所以这种缺陷型能够少量地合成某一代谢产物，能在基本培养基上少量的生长失，所以这种缺陷型能够少量地合成某一代谢产物，能在基本培养基上少

20、量的生长 理性化筛选 (2) (2) 筛选负变株的回复突变株筛选负变株的回复突变株 选择经过诱变处理后抗生素生产能力明选择经过诱变处理后抗生素生产能力明 显降低或完全丧失，但其他性状仍近于正常显降低或完全丧失，但其他性状仍近于正常 的突变株作为实验材料，进行诱变，再挑选的突变株作为实验材料，进行诱变，再挑选 高产菌株。高产菌株。 理性化筛选 (3) (3) 筛选去磷酸盐调节突变株筛选去磷酸盐调节突变株 能在磷酸盐抑制浓度下，正常合成抗生素的突变株能在磷酸盐抑制浓度下，正常合成抗生素的突变株 磷酸盐结构类似物磷酸盐结构类似物( (砷酸盐、钒酸盐砷酸盐、钒酸盐) )抗性突变株抗性突变株 (4)(4

21、)筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选去碳源分解代谢调节突变株 能被菌快速利用的碳源在被快速分解利用时，能被菌快速利用的碳源在被快速分解利用时， 往往对许往往对许 多其他代谢途径中的酶有阻遏或抑制作多其他代谢途径中的酶有阻遏或抑制作 用，成为抗生素发酵产量的限制因素。筛选去碳源用，成为抗生素发酵产量的限制因素。筛选去碳源 分解代谢调节突变株，可提高抗生素发酵产量，简分解代谢调节突变株，可提高抗生素发酵产量，简 化生产工艺。化生产工艺。 理性化筛选 筛选出赖氨酸类似物抗性株筛选出赖氨酸类似物抗性株 (5) (5) 筛选氨基酸结构类似物抗性突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 半光氨酸、缬氨酸半光氨酸

22、、缬氨酸青霉素前体青霉素前体青霉素青霉素 理性化筛选 (6) (6) 筛选二价金属离子抗性突变株筛选二价金属离子抗性突变株 (7) (7) 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 不能合成或很少合成的前体不能合成或很少合成的前体 苯乙酸和苯氧乙酸（有毒性）苯乙酸和苯氧乙酸（有毒性）青霉素侧链前体青霉素侧链前体 能合成但不能大量累积的中间产物能合成但不能大量累积的中间产物 丙酸（干扰初级代谢中间产物）丙酸（干扰初级代谢中间产物）红霉素红霉素 初级代谢终产物，有反馈作用不能大量累积。初级代谢终产物，有反馈作用不能大量累积。 缬氨酸缬氨酸青霉素青霉素 (8)(8)筛选自

23、身所产的抗生素抗性突变株筛选自身所产的抗生素抗性突变株 理性化筛选 1、营养缺陷型菌株筛选 所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产 生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某 种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基 本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加 一定种类的有机物质后才能生长。一定种类的有机物质后才能生长。 补充内容 1 ）筛选用培养基 补充内容 2）营养缺陷型菌株筛选的一

24、般方法 补充内容 补充内容补充内容 影印平板法筛 选目的菌 将突变菌株放到完全致死的环境中，一 次性筛出抗性突变株。 包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌 体 2 2、抗性突变株筛选、抗性突变株筛选 补充内容 培养基 发酵条件 4.突变菌株高产基因的表达突变菌株高产基因的表达 一、定义和特点 二、原理 三、常规的杂交育种：准性生殖方式杂交 四、原生质体融合技术 第四节杂第四节杂 交交 育育 种种 技技 术术 杂交育种杂交育种 一般是指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体一般是指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体 融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性融合使遗传物质重新组合，再从

25、中分离和筛选出具有新性 状的菌株。状的菌株。 一、定义和特点一、定义和特点 定向 杂交后对诱变剂敏感消除诱变效应饱和 改变产品质量和产量 操作复杂，技术要求高，推广和应用受限 特点特点 二、原理二、原理 1.理论基础理论基础 2.重组与杂交的关系重组与杂交的关系 v 重组重组分子水平，杂交分子水平，杂交细胞水平细胞水平 v 杂交中必然包含着重组；杂交中必然包含着重组； v 重组则不限于杂交这一形式。重组则不限于杂交这一形式。 (一一)遗传标记遗传标记 所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产 生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某生的一种生

26、化突变体。由于基因突变，它失去了合成某 种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基 本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加 一定种类的有机物质后才能生长。一定种类的有机物质后才能生长。 营养标记菌株（营养缺陷型菌株）是最常用的营养标记菌株（营养缺陷型菌株）是最常用的 遗传标记之一。遗传标记之一。 三、常规的杂交育种三、常规的杂交育种 ( (二二) )异核体形成异核体形成 ( (三三) )杂合二倍体的形成杂合二倍体的形成 * *提高异核二倍体的培养温度提高异核二倍体的培养温度 * *用

27、紫外线照射异核体用紫外线照射异核体 * *樟脑蒸汽熏樟脑蒸汽熏 特点：特点：体积、体积、DNADNA含量明显大于直接含量明显大于直接 亲本；具有较高的酶活性，生长速率亲本；具有较高的酶活性，生长速率 和糖的利用率较快。和糖的利用率较快。 提高异核体形成杂合二倍体的常用方法：提高异核体形成杂合二倍体的常用方法： （四）重组 1染色体交换 发生在体细胞的有丝分裂过程中。 特点：形成的两个子细胞仍为双倍体细胞，但 基因型不同。 2染色体单倍化 基因重组基因重组 甲甲 生长快、产量低 乙 生长慢、产量高生长慢、产量高 生长快、产量高生长快、产量高 应用应用 面包酵母:对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强， 产生

28、 CO2 多，生长快； 酒精酵母:产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的 发酵力弱 杂交:就得到了既能生产酒精，又能将其残 余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良 菌种。 四、原生质体融合四、原生质体融合 用脱壁酶处理，将微生物细胞壁除去，用脱壁酶处理，将微生物细胞壁除去， 制成原生质体，再用聚乙二醇（制成原生质体，再用聚乙二醇（PEGPEG）促进）促进 原生质体融合，从而获得异核体或重组子，原生质体融合，从而获得异核体或重组子， 这一技术叫原生质体融合。这一技术叫原生质体融合。 （一）原生质体融合育种步骤 1.标记菌种的选择 一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状 作为标记，且标记必须稳定。 2.2.原生质体的制备原生质体的制备 在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶； 酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。 1 1）菌体的前处理（）菌体的前处理（EDTAEDTA、青霉素）、青霉素） 2 2）菌体的培养时间）菌体的培养时间 4 4）酶处理温度）酶处理温度 3 3）酶浓度）酶浓度 5 5）酶解时间）酶解时间 6 6）渗透压稳定剂（甘露醇、蔗糖、）渗透压稳定剂（甘露醇、蔗糖、KClK